歐陽效強，饒 煉，雷 敏，陳曉坤，洪創(chuàng)雄

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是危害我國全民健康的首要疾病，據(jù)推算，目前我國CVD 人數(shù)約2.9 億，CVD 所導致死亡人數(shù)占全民疾病死亡人數(shù)的40%以上，比腫瘤還高，而且CVD 患病率及死亡率仍然在不斷增加［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是眾多心腦血管疾病形成的主要病理基礎之一，因此，有效防治AS 對于預防心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。目前，西醫(yī)降脂、抗血小板聚集等藥物雖然能夠有效的延緩AS 的發(fā)生和發(fā)展，但是也存在諸多問題，如調(diào)脂藥物易導致肝腎功能損害及橫紋肌溶解［2］，抗血小板藥物容易引起胃腸道不適和出血等［3］。而中醫(yī)藥在治療動脈粥樣硬化方面有獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)藥能夠從整體上調(diào)節(jié)臟腑功能，延緩疾病進展，改善患者的臨床癥狀，而且毒副作用?。?］。因此，中醫(yī)藥為動脈粥樣硬化的防治提供了一個很好的方向。

中醫(yī)學沒有“AS”的病名，但從病因病理、臨床癥狀以及發(fā)病部位的不同，臨床上常常將冠狀動脈粥樣硬化，頸動脈硬化，腦動脈硬化歸屬于“脈痹”“胸痹心痛”“眩暈”“中風”等范疇。目前多數(shù)醫(yī)家認為AS 的基本病機為“本虛標實”，氣陰兩虛為本，痰、瘀、毒為標，治療上益氣養(yǎng)陰治其本，活血、化痰、解毒治其標［5］，臨床有較多醫(yī)家常以生脈散加減治療。國醫(yī)大師鄧鐵濤教授和陳可冀院士在治療氣陰兩虛型冠心病時，常用生脈散加減［6-7］。洪創(chuàng)雄教授多年致力于心血管疾病研究，常以生脈散加減治療冠心病，臨床療效確切，值得推廣。

生脈散出自《醫(yī)學啟源》，由三味藥組成（人參、麥冬、五味子）。方中人參甘溫補氣生津為君；麥冬甘而微寒，養(yǎng)陰生津為臣，五味子味酸而咸，擅長固津攝氣為佐，三藥合用，一補一潤一斂，益氣養(yǎng)陰生津，是治療氣陰兩虛的經(jīng)典名方?，F(xiàn)代藥理研究表明，生脈散具有調(diào)節(jié)血脂、減輕炎癥反應、抗氧化［8］等作用，這為生脈散防治AS 提供了一定的科學依據(jù)。同時臨床也有較多文獻報道生脈散能夠用于治療AS，但大多是從單一個角度去解釋其可能作用機制，缺乏系統(tǒng)性研究。而中藥成分的復雜性及作用的整體性提示我們，生脈散可能通過多成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用，因此需要我們進行深入系統(tǒng)的研究和探討。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，構(gòu)建生脈散-AS-靶點相互關(guān)系網(wǎng)絡，研究生脈散中多種成分、多個靶點與AS 的相互作用關(guān)系，從整體上系統(tǒng)的探討生脈散治療AS 的作用機制，并為后續(xù)深入開展實驗研究和臨床應用提供指導。

1 方法

1.1 生脈散活性成分與潛在靶點篩選 首先在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）分別輸入“人參、麥冬、五味子”3 味中藥藥名，查找三者全部化學成分，篩選條件是化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，然后查找化合物對應的靶點。由于在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中沒有“麥冬”的相關(guān)成分，故通過中醫(yī)分子機理生物學信息分析工具（BATMAN-TCM，http：／ ／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）進行檢索，篩選條件是Score cutoff ≥20、P-value cutoff＜0.05［9］。通過上述2 個數(shù)據(jù)庫檢索得到生脈散3 味中藥的化合物和靶點，將結(jié)果合并，建立生脈散化學成分—靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 AS 疾病靶點的確定 通過TTD 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、CTD 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／ctdbase.org／）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.omim.org／）、DisGenet 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／disgenet.org／），搜集與AS 相關(guān)的靶點。

1.3 成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 篩選生脈散活性成分潛在作用靶點及AS 疾病靶點，通過韋恩圖取交集得到兩者的共同靶點，并進行藥物成分靶點-AS 疾病靶點映射，利用Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建“藥物成分-作用靶點”互作網(wǎng)絡。藥物活性成分和作用靶點以“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互作用以“邊”表示。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建 將生脈散和AS 共同作用靶點代入STRING（https：／ ／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫中，以置信度分數(shù)score＞0.9 為條件進行篩選，其余參數(shù)不變。將得到的結(jié)果以文本形成導入Cytoscape3.6.1 軟件，構(gòu)建PPI 相互作用網(wǎng)絡圖。

1.5 基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用David 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.GOv／）對生脈散和AS 共同作用靶點蛋白進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能；KEGG 富集分析可以得到生脈散和AS 共同靶點所富集的信號通路。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義［10］。

2 結(jié)果

2.1 生脈散化合物 在2 個數(shù)據(jù)庫（TCMSP、BATMANTCM）進行檢索篩選后，得到人參、麥冬、五味子的有效化合物45 個，其中人參22 個，麥冬18 個，五味子8 個，其中3 個為共有成分，與此對應的化合物預測靶點有418 個。

2.2 AS 疾病靶點 在疾病靶點數(shù)據(jù)庫（TTD、CTD、OMIM 和DisGenet）查找檢索AS 的疾病作用靶點，共得到254 個。

2.3 治療AS 化合物及潛在靶點 利用韋恩圖獲得生脈散和AS 兩者的共同作用靶點46 個，分別對應23 個活性化合物（人參13 個，五味子5 個，麥冬7 個），見圖1，化合物見表1。由此可知，生脈散可以通過多種成分作用于AS疾病的多個相關(guān)靶點來發(fā)揮作用。

圖1 生脈散-動脈粥樣硬化共同基因靶點

表1 生脈散中23 個化合物

2.4 成分-靶點網(wǎng)絡及靶點互作分析 將生脈散活性成分和作用靶點信息導入Cytoscape3.6.1 軟件，構(gòu)建生脈散治療AS 的“成分-靶點”網(wǎng)絡圖，共包含72 個節(jié)點（23 個成分節(jié)點，46 個基因節(jié)點，3 個藥物節(jié)點）、124 條邊，見圖2。在網(wǎng)絡中，一個節(jié)點的度（degree）表示網(wǎng)絡中和節(jié)點相連路線的條數(shù)，度值越大則表明該化合物發(fā)揮作用的可能性越大，故圖1 中度值大于等于5（中位數(shù)）的化合物有8 個，分別為羥基苯甲酸（degree ＝23）、山柰酚（degree＝17）、豆甾醇（degree＝12）、麥冬黃烷酮E（degree ＝6）、甲基麥冬黃烷酮B（degree ＝6）、人參皂苷rh2（degree ＝5）、灌木遠志酮 A（degree ＝5）、β-谷甾醇（degree＝5），可能是生脈散抗AS 的重要成分。

圖2 生脈散化合物-疾病靶點互作網(wǎng)絡

2.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡 將46 個共同靶點導入STRING 中，構(gòu)建生脈散治療AS 潛在靶點PPI 網(wǎng)絡，將結(jié)果以文本形式導出，然后導入Cytoscape3.6.1 軟件中，利用network analyzer 插件進行網(wǎng)絡拓撲分析，得到潛在靶點基因拓撲參數(shù)自由度（degree）、介度中心度（betweenness）和接近中心度（closeness），自由度表示節(jié)點所包含的邊的數(shù)目，靶點自由度越大，表明通過該靶點發(fā)揮作用的可能性越大。結(jié)果，自由度≥15（中位數(shù)）的靶點有22 個，具體見表2，相互作用關(guān)系見圖3。

2.6 GO 功能富集分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫中對生脈散和AS 的共同靶點進行GO 功能富集分析，根據(jù)P＜0.05 確定了101 個GO 條目，其中與生物過程（BP）相關(guān)的條目73個；與細胞組成（CC）相關(guān)的條目7 個，主要涉及細胞外空間、核、質(zhì)膜外側(cè)、高爾基體、細胞外基質(zhì)等方面；與分子功能（MF）相關(guān)的條目21 個，主要涉及脂質(zhì)代謝、炎癥反應、信號傳導、調(diào)節(jié)胰島素分泌、血管收縮調(diào)節(jié)、平滑肌細胞增殖、雌激素、內(nèi)皮細胞等方面，推測生脈散可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來起到治療AS 的作用，具體見表3。

表2 22 個核心靶點

圖3 生脈散核心靶點PPI 網(wǎng)絡

2.7 KEGG 通路富集分析 通過DAVID 對46 個靶點進行KEGG 通路分析，得到35 條生物學通路，根據(jù)P＜0.05 并結(jié)合相關(guān)文獻進行篩選，得到AS 相關(guān)通路22 條，具體見表4。

3 討論

本研究系統(tǒng)分析了生脈散（麥冬、人參、五味子）的有效成分，預測了治療AS 的相關(guān)靶點，構(gòu)建了生脈散-AS-靶點網(wǎng)絡。通過對生脈散-靶點網(wǎng)絡分析得出生脈散治療AS 的主要成分是山柰酚、豆甾醇、麥冬黃烷酮E、甲基麥冬黃烷酮B、人參皂苷rh2、β-谷甾醇等。山柰酚是人參的重要成分，是一種有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成和血小板活性等作用的黃酮類化合物［11］；有研究報道山柰酚具有很好的抗炎特性，能夠抑制促炎因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）釋放，增加抑炎因子白介素10（IL-10）的表達和分泌［12-13］；山柰酚不僅可以保護低密度脂蛋白免受氧化，還可以通過抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取來預防AS［14］。此外，山柰酚還能抑制凝血酶和FXa 的酶活性，起到抑制血栓形成和血小板活化的作用［15］，而血小板聚集和血栓形成是AS 的發(fā)病機制之一，因此有一定的治療AS 的作用。豆甾醇為人參和麥冬共有成分，它具有抑制血管緊張II 刺激的A7r5 大鼠大動脈血管平滑肌細胞增殖，具有一定的抗AS 的作用［16］。甲基麥冬黃烷酮B 是麥冬的有效成分，能夠顯著下調(diào)促炎因子白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素8（IL-8）的表達，起到抗慢性炎癥作用［17］。

表3 生脈散-AS-基因的生物學過程

通過對生脈散核心靶點PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析，共分析22 個關(guān)鍵靶點，這些靶點涉及脂質(zhì)代謝、炎癥反應、胰島素分泌、細胞因子、細胞增殖與遷移等生物學過程。通過GO 功能富集分析也提示生脈散治療AS 涉及上述生物學過程。此外，KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示生脈散可能通過PPAR 信號通路、胰島素抵抗、TNF 信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路起到治療AS 的作用。

表4 生脈散-AS-基因通路富集分析（P 值排名前十）

目前認為，炎癥反應在AS 病理過程中起著基礎性作用［18］。TNF 信號通路、NF-κB 信號通路的激活對促進AS發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。TNF-α 是血管內(nèi)皮細胞損傷或?qū)е卵芄δ芪蓙y的重要炎癥因子，它可使血管損傷和血栓形成，并能夠激活誘導NF-κB 入核，激活NF-κB 信號通路，促進TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子的釋放，從而引起和加重機體炎癥反應［19］。有研究顯示，生脈散可以降低中暑大鼠血清白介素1β（IL-1β）、IL-6、TNF-α 的水平，預防中暑引起的低血壓和腦缺血損害［20］。邢清敏、陸曙等在利用生脈散干預擴張型心肌病大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，生脈散可通過下調(diào)Toll 樣受體4（TLR-4）和NF-κB 的基因、蛋白表達，從而抑制TLR-4 ／NF-κB 信號通路，降低炎癥因子IL-6、TNF-α 的水平［21］。本研究通過分析，發(fā)現(xiàn)TNF 是生脈散和AS 的核心靶點，結(jié)合既往研究，生脈散可能通過調(diào)控TNF-α 和TNF 信號通路、NF-κB 信號通抑制炎癥反應。

胰島素抵抗和AS 的形成密切相關(guān)，機體在發(fā)生胰島素抵抗時，胰島素信號通路受損引起血管內(nèi)皮功能紊亂和血管平滑肌細胞增殖和遷移、誘導細胞凋亡［22-23］。而血管內(nèi)皮功能受損和血管平滑肌細胞遷移增殖是AS 的早期病理表現(xiàn)。吳小慧等實驗研究顯示生脈散能夠降低2 型糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP 等的水平，改善胰島素抵抗，并能夠降低血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平，起到抗AS 作用［24-25］。結(jié)合網(wǎng)絡藥理學研究，生脈散和AS共同靶點涉及胰島素抵抗、1 型糖尿病、2 型糖尿病。由此，我們可以推測，生脈散可以通過改善胰島素抵或通過治療糖尿病發(fā)揮防治AS 的作用。

氧化應激損傷也是AS 發(fā)病機制之一，氧化應激能升高氧化低密度脂蛋白水平，促進泡沫細胞形成，損害血管內(nèi)皮細胞，促進炎癥反應和細胞增殖、凋亡，從多個方面參與AS 的發(fā)生發(fā)展［26］。前期已有研究表明，生脈散提取物能夠通過清除過氧化氫（H2O2）、活性氧（ROS）發(fā)揮抗氧化應激的作用［27-28］。在慢性間歇性缺氧小鼠模型的實驗中也證實了生脈散能降低丙二醛（MDA），增加超氧化物歧化酶（SOD）水平，顯示出良好的抗氧化活性［29-30］。也有研究顯示，加味生脈散能夠延緩家兔AS 斑塊的形成，并能夠降低甘油三酯（TG）的水平，提示加味生脈散具有調(diào)節(jié)血脂的作用［31］。

過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR）主要有 PPAR-α、PPAR-β 和PPAR-γ 三種表型，其中PPAR-α、PPAR-γ 與AS 密切相關(guān)。研究表明，PPAR-α 和PPAR-γ 的激活能通過抑制血管內(nèi)皮炎癥反應，抑制細胞增殖和遷移，抑制單核細胞轉(zhuǎn)化成泡沫細胞，減少血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達等多個方面，發(fā)揮抗AS 的作用［32］。此外激活的PPAR-α 在調(diào)節(jié)脂肪代謝，尤其是降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的濃度發(fā)揮著重要作用［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α 和PPAR-γ 是生脈散和動脈粥樣硬化的共同作用靶點。因此我們推測，生脈散有可能通過調(diào)節(jié)PPAR 信號通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血脂水平，抑制炎癥反應、細胞增殖和遷移、單核細胞轉(zhuǎn)化等防治AS。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡藥理學研究方法，構(gòu)建了生脈散-AS-靶點互作網(wǎng)絡，通過分析得出，生脈散能夠通過作用于胰島素、腫瘤壞死因子等多個靶點，調(diào)節(jié)胰島素信號通路，TNF 信號通路、NF-κB 信號通路、PPAR 信號通路等多條途徑，發(fā)揮改善胰島素抵抗，抑制炎癥反應，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化應激等作用來防治動脈粥樣硬化。該研究從整體水平，預測和分析了生脈散治療動脈粥樣硬化的作用機制，對于后續(xù)研究提供了很好的指導。