張友剛 李昊楠史永平 張姍姍李曉彬曾英姿韓利文田青平?劉可春

［1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）， 山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南 250103；3.山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司，山東濰坊 261205；4.山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250001］

腦出血（cerebral hemorrhage，CH）是一種常見的腦血管疾病，其通常是由腦內(nèi)血管發(fā)生病變、壞死、破損引起，大多數(shù)患者不是由于腦出血導(dǎo)致原有病情加重，而是由于腦出血引起的一系列生理病理變化致殘致死［1-2］。腦出血一般發(fā)病較為突然，若不及時(shí)治療，輕則使患者留下后遺癥，重則導(dǎo)致患者死亡［3］。腦出血在臨床上病死率極高，受到了醫(yī)藥部門的高度重視，臨床上對(duì)于腦出血的治療包括西醫(yī)治療、中醫(yī)治療、中西醫(yī)結(jié)合治療，其中以中西醫(yī)結(jié)合治療的效果最佳。腦出血是影響我國國民健康的重大公共衛(wèi)生問題，防治腦出血的發(fā)生、發(fā)展十分重要。

中醫(yī)認(rèn)為，腦出血為“瘀血阻滯，脈道不利”，治療上多采用活血化瘀的方法［4］。腦血疏口服液是我國國家中藥保護(hù)品種，具有益氣、活血、化癖，通腑的功效［5］。腦血疏口服液由黃芪、大黃、牛膝、牡丹皮、石菖蒲、川芎、水蛭7 味中藥制成，是唯一一個(gè)治療腦出血的中成藥。臨床實(shí)驗(yàn)表明腦血疏口服液可以顯著加快血腫吸收、具有顯著改善神經(jīng)功能受損和臨床綜合癥狀的作用，對(duì)于腦出血患者的急性期和康復(fù)期具有良好的療效。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，這種復(fù)雜性使得中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制不明確［6］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)開發(fā)的一門新興學(xué)科，隨著與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)的多學(xué)科的快速發(fā)展，國內(nèi)外越來越多的學(xué)者運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來探索疾病與藥物更深層次的關(guān)聯(lián)［7］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)發(fā)掘腦血疏口服液治療腦出血的機(jī)理，通過建立“藥效成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，深入探討腦血疏口服液治療腦出血的藥效物質(zhì)、作用機(jī)制，為中藥現(xiàn)代化研究提供參考。

1 方法

1.1 腦血疏口服液化學(xué)成分信息的收集 通過TCMSP（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／index.php）及文獻(xiàn)收集腦血疏口服液7 味中藥（黃芪、大黃、牛膝、牡丹皮、石菖蒲、川芎、水蛭）的全部化學(xué)成分，并通過TCMSP、Pubchem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并保存Smiles 格式。

1.2 活性成分的篩選 口服吸收利用度（OB／%）和藥物相似性（DL）是藥物篩選過程中兩個(gè)重要的ADME 參數(shù)，常用于評(píng)價(jià)化合物的成藥性［8］。本研究選取同時(shí)滿足OB≥30%、DL≥0.18 的化合物作為潛在活性成分，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)水蛭中不滿足以上2 個(gè)條件的活性成分也進(jìn)行收錄［9］。

1.3 成分靶點(diǎn)的篩選、疾病靶標(biāo)的收集 Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）服務(wù)器是基于分子的二維和三維結(jié)構(gòu)與已知蛋白分子的作用程度來預(yù)測(cè)化合物的潛在靶標(biāo)，從而精準(zhǔn)的得到未知化合物的作用靶標(biāo)［10］。將篩選得到的潛在活性分子的Smiles 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫，并選定研究物種為人類（homo sapiens），導(dǎo)出潛在化學(xué)成分的靶標(biāo)。以“cerebral hemorrhage”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（https：／ ／www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫、DisGeNET（http：／ ／www.disgenet.org／search）數(shù)據(jù)庫中腦出血相關(guān)基因，并去除重復(fù)基因。

1.4 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)以上預(yù)測(cè)結(jié)果，采用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)模型，節(jié)點(diǎn)（node）代表單味藥、潛在活性成分與潛在作用靶點(diǎn)，邊（edge）用來連接單味藥與活性成分、活性成分與作用靶點(diǎn)，展現(xiàn)單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.5 交集基因的獲取及其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將腦血疏口服液作用靶點(diǎn)基因和腦出血的相關(guān)基因分別輸入在線韋恩圖繪制網(wǎng)站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）獲取交集基因，交集基因即為腦血疏口服液治療腦出血的潛在靶點(diǎn)。將獲取的交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／string-db.org／），然后將獲取的交集基因信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 繪制交集基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 交集基因的生物分子功能注釋 將獲取的交集基因靶點(diǎn)信息采用 David6.8 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG 通路分析。其中GO 注釋分析分為3 個(gè)部分，分別為生物過程分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和生物過程（biological process，BP）。利用David6.8 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）進(jìn)行通路富集分析，將通路富集分析的結(jié)果通過Omicshare（http：／ ／www.omicshare.com／tools／index.php／）對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7 主要活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 LeDock 是蘇黎世大學(xué)趙洪桃在博士期間開發(fā)的一款跨平臺(tái)分子對(duì)接軟件，在速度和準(zhǔn)確度上均呈現(xiàn)出強(qiáng)勁的優(yōu)勢(shì)［11］，它采用遺傳算法和模擬退火算法相結(jié)合的方法對(duì)配體的構(gòu)象進(jìn)行取樣［12］，其蛋白處理過程十分方便，可實(shí)現(xiàn)水分子、雜原子、離子的去除，同時(shí)氫原子也可以自動(dòng)加上。將“1.6”項(xiàng)下的主要活性成分通過Chem3D Pro 14.0 得到其MOL2 格式，通過Uniprot（https：／ ／www.uniprot.org／）、RCSBPDB（http：／ ／www.rcsb.org／）數(shù)據(jù)庫獲取主要活性成分作用于疾病靶點(diǎn)的PDB 蛋白晶體，并保存為PDB 格式，為分子對(duì)接做好前期準(zhǔn)備。將靶點(diǎn)蛋白晶體及對(duì)應(yīng)的配體先后導(dǎo)入LeDock 進(jìn)行分子對(duì)接，保存對(duì)接后產(chǎn)生的DOK 文件用于展示對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 腦血疏口服液7 味中藥潛在活性成分及腦出血相關(guān)靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出潛在活性成分，分別為黃芪20 種，石菖蒲4 種，牛膝20 種，牡丹皮11 種，大黃16 種，川芎7 種，合并去重后得到70 種，再查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)水蛭45 種潛在活性成分，最終得到115 種，具體見表1。通過DisGeNET 數(shù)據(jù)庫搜集到疾病靶標(biāo)66 個(gè)，在Genecards數(shù)據(jù)庫以Relevance score 的中位數(shù)的2 倍為卡值，獲得647 個(gè)疾病靶標(biāo)，將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫的疾病靶標(biāo)去重，最終得到656 個(gè)。

2.2 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 將單味藥-活性成分信息、活性成分作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，采用Merge 工具繪制“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”圖，見圖1，一共有561 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 833 條邊。通過Network Analyzer 計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，發(fā)現(xiàn)潛在成分作用靶點(diǎn)Degree值（網(wǎng)絡(luò)模型中每個(gè)節(jié)點(diǎn)與其相連節(jié)點(diǎn)的數(shù)目）＞20 的有15 個(gè)，排名前5 的是TDP1、MAPT、CYP19A、MBNL、CA1，分別有69、57、26、26、24 個(gè)化合物與其發(fā)生相互作用。

2.3 交集基因及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 通過在線韋恩圖，得到腦血疏口服液潛在活性成分作用靶點(diǎn)與腦出血疾病作用靶點(diǎn)的交集基因有66 個(gè)，見圖2。將其導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)Cytoscape 3.7.1 處理后得到蛋白質(zhì)相互作用圖，見圖3，包括66 個(gè)節(jié)點(diǎn)、和595 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為18.03。

表1 腦血疏口服液中7 味中藥潛在活性成分

續(xù)表1

圖1 腦血疏口服液成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 腦血疏口服液成分靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 交集基因蛋白質(zhì)相互作用

2.4 生物功能通路分析 將66 個(gè)基因?qū)隓avid 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 分析，以P＜0.01、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖4。由此可知，從生物過程層面上看，腦血疏口服液對(duì)蛋白質(zhì)自磷酸化、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等影響較大；從細(xì)胞組分層面上看，腦血疏口服液對(duì)質(zhì)膜、細(xì)胞表面、受體復(fù)合物、膜筏、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外間隙等影響較大；從分子功能層面上看，腦血疏口服液對(duì)酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、四氫生物蝶呤結(jié)合、血紅素結(jié)合等影響較大。前20 條通路見圖5。

圖4 腦血疏口服液治療腦出血候選靶點(diǎn)的GO 富集分析

圖5 KEGG 分析

2.5 腦血疏口服液活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型 將富集分析排名前20 的通路所對(duì)應(yīng)的腦血疏口服液潛在活性成分和作用靶點(diǎn)構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，見圖6，包括116 個(gè)節(jié)點(diǎn)、366 條邊。由此可知，ESR1、AKT1、AKT3、EGFR、PIK3CA 節(jié)點(diǎn)度值排名靠前，可能是腦血疏口服液治療腦出血的核心靶點(diǎn)。

2.6 分子對(duì)接 將活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中排名前五的化合物與其作用于腦出血的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2，可知槲皮素與基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）具有較好的結(jié)合活性，大部分活性成分與其作用的治療腦出血的靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合性能。再將已知的能特定作用于MMP3 的抑制劑伊洛馬司他（Ilomastat，PubChem CID：132519）與1HY7 進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)合能為-10.39 kcal／mol。另外，槲皮素、伊洛馬司他都是通過疏水相互作用、氫鍵、配位鍵與1HY7 相互作用，以PyMol V1.8 和Ligplot+V2.1 展示對(duì)接結(jié)果，見圖7。

圖6 腦血疏口服液治療腦出血活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表2 腦血疏口服液主要活性成分-作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

圖7 1HY7 與槲皮素、伊洛馬司他的分子對(duì)接

3 討論

腦出血是指非外傷性腦內(nèi)實(shí)質(zhì)出血，腦出血后腦組織會(huì)發(fā)生一系列病理生理變化，分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者包括血腫增大、血腫機(jī)械壓迫，后者包括血紅蛋白毒性作用、炎性反應(yīng)、凝血酶釋放、局部腦組織血流量減少等［13］。腦出血治療早期以消除血腫為主要治療目的，后期以繼發(fā)性損傷中的炎癥損傷為主［14-15］。

本研究系統(tǒng)分析了腦血疏口服液的有效成分，構(gòu)建了化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，在該網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的是黃芪紫檀烷苷、槲皮素、漢黃芩素、川芎嗪、桉脂素等。在腦部血管的修復(fù)過程中，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞起著關(guān)鍵的作用。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞源于骨髓，被釋放至外周血液后根據(jù)需要可以分化成各種細(xì)胞，當(dāng)分化成內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)血管的新生以及內(nèi)皮破損的修復(fù)在各種病理和組織工程學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用［16-17］。孫軍［18］等研究表明，槲皮素能夠刺激血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖與分化，從而促進(jìn)損傷血管的修復(fù)。川芎嗪能夠保護(hù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴［19］。除此之外，川芎嗪具有較強(qiáng)的抗血小板作用，和一定的抗血栓作用［20］。川芎嗪可能通過抑制血小板聚集、降低血液黏滯度、改善腦部血管循環(huán)，從而達(dá)到避免腦部組織缺血缺氧的目的。腦出血后，缺血中心區(qū)將發(fā)生不可逆性的神經(jīng)損傷，而缺血半暗帶發(fā)生的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是可逆的［21］。漢黃芩素通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥激活來保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，而不直接作用于神經(jīng)元細(xì)胞［22］。上述文獻(xiàn)報(bào)道與本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的槲皮素、川芎嗪、漢黃芩素可能的活性作用一致。除此之外，存在一些未被報(bào)道的活性成分，將成為未來研究腦出血治療腦出血的潛在方向，如黃芪紫檀烷苷、桉脂素等。

腦血疏口服液治療腦出血涉及多個(gè)靶點(diǎn)，成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)提示，ESR1、AKT1、PIK3CA、AKT3、EGFR、PTGS2、MMP2、MMP3 等靶點(diǎn)在治療腦出血的過程中發(fā)揮著重要的作用。蘇氨酸蛋白激酶AKT1 和AKT3 能夠激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，從而促進(jìn)腦出血后局部腦組織缺血造成的損傷神經(jīng)干細(xì)胞的增殖［23］。MMP2 和MMP3 同屬M(fèi)MPs，二者的激活能夠誘發(fā)腦出血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血腦屏障的破壞以及腦部神經(jīng)功能的損傷，抑制MMPs 的過表達(dá)能夠起到保護(hù)血腦屏障及腦部神經(jīng)的作用［24］。除此之外，成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)揭示了諸如PTGS2、NOS2、NOS3 等炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)在治療腦出血時(shí)的重要性。在分子對(duì)接驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，槲皮素和伊洛馬司他與1HY7具有較好的結(jié)合能力，兩者結(jié)合位點(diǎn)相同，而且都能夠與MMP3 中的鋅形成配位鍵，抑制MMP3 的表達(dá)，從而驗(yàn)證了靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的可靠性。

本研究將所得到的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析得到與腦出血可能相關(guān)的通路，如PI3K-Akt、腫瘤壞死因子（TNF）、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）、細(xì)胞凋亡（apoptosis）、ErbB、Rap1 信號(hào)通路等，與炎癥、代謝、血腦屏障功能、神經(jīng)元保護(hù)及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。腦出血后，由于血腫等原因致使局部組織血流量減少，缺血部位組織細(xì)胞就會(huì)處于低氧狀態(tài)。HIF-1 信號(hào)通路的激活在缺血后細(xì)胞代謝中的作用發(fā)揮著重要的作用，參與重建細(xì)胞代謝途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)腦組織的保護(hù)［25］。腦出血患者發(fā)病幾天后血腫程度與TNF-α 水平呈正相關(guān)［26］，其高表達(dá)是血腦屏障破損、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等繼發(fā)性損傷的重要原因［15］。腦血疏口服液活性成分可能通過作用于TNF 信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)，抑制TNF-α 的過表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)血腦屏障、減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等目的。

綜上所述，腦血疏口服液通過多成分作用于多靶點(diǎn)，從而協(xié)同調(diào)控多種通路，從整體網(wǎng)絡(luò)層面發(fā)揮抗腦出血作用，展現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥有別于小分子化藥的作用特點(diǎn)。關(guān)于腦血疏的關(guān)鍵活性化合物、作用靶點(diǎn)和通路還需要深入的驗(yàn)證研究，為今后臨床治療提供理論依據(jù)。