徐變玲王 楠張 理徐學(xué)功

（1.鄭州市中醫(yī)院，河南鄭州 450007；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450046）

高脂血癥是指血清中膽固醇和（或）甘油三酯水平升高，是一種發(fā)病隱匿的內(nèi)分泌疾?。?］。直至2015 年，我國成人患有高脂血癥人群占總?cè)丝?0.4%，并且呈現(xiàn)逐年增高的趨勢［2］。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為高脂血癥屬于本虛標(biāo)實之證。本虛是指臟腑功能虛衰，以脾胃氣虛肝腎陰虛為主；標(biāo)實是指痰瘀交阻而內(nèi)留，以痰濁、血瘀為主［3］。降脂輕身方由蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、半夏、大黃、番瀉葉、牽牛子、薏苡仁、澤瀉、大腹皮、木香、枳實、陳皮、丹參、生山楂等組成。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，治療血脂異常臨床療效確切［4］。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 個核苷酸單位，不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA［5］。lncRNA 在不同生物過程中發(fā)揮重要作用，參與了表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，并與人類的重大疾病密切相關(guān)［6］。有研究報道，lncRNA 在心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用［7］。

本實驗通過降脂輕身方對高脂血癥小鼠的降脂作用為研究對象，以mRNA 和lncRNA 的的表達(dá)芯片為研究手段，分析降脂輕身方的作用靶點及代謝通路，來探究其改善高血脂的機制，為臨床治療高脂血癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 分組與給藥 采用SPF 級C57BL／6 背景6 周齡健康雄性野生型小鼠和ApoE-／-健康雄性小鼠為研究對象，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011。適應(yīng)環(huán)境1 周后，以11 只C57BL／6 小鼠為正常對照組，給予普通飲食（玉米24.5%，麩皮24.5%，大麥21%，豆餅12%，魚粉6%，其他輔料12%，不包含膽固醇或動物油等任何高脂成分）；ApoE-／-小鼠隨機分為（1）模型組，給予普通飲食；（2）給藥組，在普通飲食中加入降脂輕身方（按照成人20 粒／d 進(jìn)行換算，每只1.365 g／kg，每組11 只。所有小鼠均飼養(yǎng)于恒溫（22 ℃）恒濕（60%）環(huán)境中，12 h 明暗交替，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)16 周。小鼠禁食過夜，次日稱量體質(zhì)量并記錄，眼球取血后處死，血液于室溫靜置分層后，3 500 r／min離心5 min 吸取上層血清進(jìn)行檢測，手術(shù)剪打開胸腔，剪斷下腔靜脈，用鑷子捏住邊緣系膜，完整剪下整個肝臟，放入10 cm培養(yǎng)皿中，取肝臟中葉組織送公司測序，剩余組織保存于液氮用于后續(xù)實驗。動物實驗均于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心完成。

1.2 試劑與藥物 降脂輕身方是鄭州市中醫(yī)院應(yīng)用多年的院內(nèi)制劑（豫藥制字Z20130171 鄭），其生產(chǎn)工藝完備且符合GAP 標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)檢驗合格，頒發(fā)《醫(yī)療機構(gòu)制劑許可證》，編號201500102。制法為蒼術(shù)、白術(shù)、枳實粉碎成細(xì)粉，過100 目篩；茯苓等其余15 味藥材加水煎煮2 次，第1 次加10 倍水量，煎煮1.5 h，濾過，濾液濃縮至相對密度1.25（80 ℃）的浸膏，70 ℃干燥，加入上述藥物藥粉，混勻，裝膠囊。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，草酸鈣簇晶大而多，直徑20～160 μm，有的至190 μm（生大黃）；菊糖表面現(xiàn)放射狀紋理，小型草酸鈣方晶存在于薄壁細(xì)胞中（木香）；上下表皮細(xì)胞表面觀呈多角形，上下表皮均有平軸式氣孔，副衛(wèi)細(xì)胞大多為2 個；非腺毛單細(xì)胞，基部稍彎曲；纖維周圍薄壁細(xì)胞中含草酸鈣方晶形成晶鞘纖維（番瀉葉）。取本品內(nèi)容物13 g，加正已烷30 mL 超聲處理15 min，濾過，濾液水浴濃縮至約2 mL，作為供試品溶液；另取白術(shù)對照藥材0.5 g，加正己烷2 mL 超聲處理15 min，放置，取上清液作為白術(shù)對照藥材溶液；再取蒼術(shù)對照藥材0.5 g，與白術(shù)對照藥材相同的方法制成蒼術(shù)對照藥材溶液。按照薄層色譜法（2015 年版《中國藥典》 四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（30∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜在白術(shù)、蒼術(shù)對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點。

1.3 體質(zhì)量、血脂水平檢測 小鼠飼養(yǎng)16 周后眼眶取血處死，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、甘油三酯（（TG）、血清總膽固醇（TC）水平。

1.4 微陣列測序以及差異基因篩選 采用博奧晶典人類長鏈非編碼RNA 芯片V4 檢測。Feature Extraction 提數(shù)軟件進(jìn)行預(yù)處理分析，GeneSpring GX 軟件計算基因表達(dá)差異和統(tǒng)計學(xué)顯著性P值。根據(jù)分組信息進(jìn)行差異比較，以差異倍數(shù)FC≥2.0，P≤0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)項篩選，得到差異基因；FC（abs）值差異倍數(shù)越大，說明兩個樣品之間的差異越大；P越小，說明差異基因的可靠性越高。采用Cluster3.0軟件，進(jìn)行Cluster 分析和圖形化展示。

1.5 GO 分析 將篩選出的差異mRNA 導(dǎo)入https：／ ／david.ncifcrf.gov／數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，從生物進(jìn)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）3 層結(jié)構(gòu)描述基因產(chǎn)物功能，并進(jìn)行KEGG（KEGG pathway analysis）代謝通路分析。

1.6 共表達(dá)分析 共表達(dá)（correlation）分析的基本方法是將探針在各樣品中的標(biāo)準(zhǔn)化信號值作為數(shù)據(jù)源，進(jìn)行兩兩相關(guān)性計算和假設(shè)驗證，得到相關(guān)系數(shù)和P值。相關(guān)性算法采用Pearson 法，P值默認(rèn)不進(jìn)行多重校正，其篩選標(biāo)準(zhǔn)為Correlation＞0.99 或Correlation＜-0.99，P＜0.05。挑選上述共表達(dá)結(jié)果中關(guān)聯(lián)度最大的前1 000 個關(guān)系對，采用Cytoscape 軟件繪制其網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 靶基因預(yù)測 在“1.6”項下結(jié)果的基礎(chǔ)上，cis-預(yù)測尋找基因組位置在10 kb 之內(nèi)的lncRNA-mRNA 對，trans-預(yù)測利用blast 工具對lncRNA、mRNA（3 ‘UTR）序列進(jìn)行比對，篩選序列相似的lncRNA-mRNA 對。挑選上述靶基因預(yù)測結(jié)果中關(guān)聯(lián)度最大的前1 000 個關(guān)系對，采用Cytoscape 軟件繪制其網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用one-way ANOVA 檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、血脂 與正常對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1A。與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清TC 水平降低（P＜0.05），見圖1B。與正常對照組比較，模型組小鼠血清TG 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），見圖1C。與正常對照組比較，模型組小鼠血清LDL-C 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清LDL-C 水平降低（P＜0.05），見圖1D。2 組血清高密度脂蛋白（HDL）水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1E。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量、血脂變化

2.2 基因差異 共篩選出496 個表達(dá)上調(diào)的差異mRNA、1 595個表達(dá)下調(diào)的差異mRNA、892 個表達(dá)上調(diào)的差異lncRNA、502 個表達(dá)下調(diào)的差異lncRNA，見圖2。

圖2 基因熱圖

2.3 基因本體論 以P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，生物進(jìn)程中顯示出有375 個相關(guān)term，其中前4 個term 有RNA 剪接、核酸代謝過程、細(xì)胞大分子代謝過程、mRNA 代謝過程；細(xì)胞組分中顯示出有77 個相關(guān)term，其中前4 個有細(xì)胞內(nèi)、膜界限的細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)部分、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合的細(xì)胞器；分子功能中顯示出有125 個相關(guān)term，其中前5 個有RNA結(jié)合、核酸結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、有機環(huán)狀化合物結(jié)合、聚（A）RNA 結(jié)合。見圖3A。

以P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測出22 個KEGG 信號通路，其中前20 個為泛素介導(dǎo)的蛋白水解、Hippo 信號通路、非小細(xì)胞肺癌、細(xì)胞周期、乙型肝炎、酮體的合成和降解、mTOR 信號通路、腎細(xì)胞癌、RIG-I 樣受體信號通路、膠質(zhì)瘤、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工、ErbB 信號通路、剪接體、p53 信號通路、泛酸和CoA 的生物合成、多巴胺能突觸、胰腺癌、鞘脂信號通路、mRNA 監(jiān)控途徑、慢性粒細(xì)胞白血病。見圖3B。

2.4 共表達(dá)分析 共表達(dá)分析是以數(shù)學(xué)中相關(guān)性為基礎(chǔ)，從基因表達(dá)層面尋找表達(dá)譜相似的lncRNA-mRNA 關(guān)系對。大量功能相關(guān)的基因在相關(guān)的一組條件下有非常相似的表達(dá)譜，特別是被共同的轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控的基因，或者產(chǎn)物構(gòu)成同一個蛋白復(fù)合體，或者參與相同的調(diào)控路徑。因此，共表達(dá)分析及基于共表達(dá)結(jié)果的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建可發(fā)現(xiàn)lncRNA 與mRNA 之間可能存在的作用關(guān)系，找到影響mRNA 表達(dá)調(diào)控的lncRNA，從而發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中起中心調(diào)控作用的lncRNA 及發(fā)現(xiàn)lncRNA 可能存在的新作用機制。

使用cytoscape 軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)gi ｜ 755474360、NONMMUT009611、NONMMUT024238、NONMMUT032729、NONMMUT039056、NONMMUT047338、NONMMUT050579、NONMMUT072360、ri ｜ 2310003C21、ri ｜ B130051E08 這10個lncRNA 與100 個mRNA 存在相互調(diào)控的共表達(dá)關(guān)系。見圖4。

2.5 靶基因預(yù)測 采用反式調(diào)控預(yù)測（trans 預(yù)測），通過blast 篩選出在序列上和目標(biāo)lncRNA 互補的mRNA，再以RNAplex 計算2 條序列之間的互補能量，最終得到498 對可能與目標(biāo)lncRNA 穩(wěn)定結(jié)合的mRNA。再采用cytoscape 軟件進(jìn)行篩選作圖，建立起334 個節(jié)點靶基因相互調(diào)控圖，其中Yod1、Zfp874b、Haus2、Strbp、Rbm34、Rmdn1、gi ｜755510242、NONMMUT024722、ri ｜ 6330564D18、ri ｜A630047B03、ri ｜ F830013G24、ri ｜ G370004A16 關(guān)系度均大于10。見圖5。

3 討論

高脂血癥又稱血脂異常，包括高膽固醇血癥、高甘油三脂血癥、低高密度脂蛋白血癥和混合型高脂血癥4 種類型［8］。高脂血癥可作為代謝綜合征的組分之一，與肥胖癥、2 型糖尿病、高血壓、冠心病、腦卒中等多種疾病密切相關(guān)［9］。

目前認(rèn)為高脂血癥屬中醫(yī)學(xué)“膏脂”“脂濁”“痰濁”等范疇［10］。中醫(yī)認(rèn)為高脂血癥屬于本虛標(biāo)實，其主要病機是痰濁血瘀，致使肝脾腎虛，阻滯經(jīng)脈，從而使膏脂布化失度［11］。降脂輕身方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，全方體現(xiàn)了化痰除濕、瀉濁逐瘀之治法。但降脂輕身方作用的分子機制尚不明確，本研究從lncRNA 與mRNA 表達(dá)譜變化，來探討改善高脂血癥的分子機理。

通過對模型組與給藥組的ApoE-／-小鼠的肝臟組織差異基因篩選以及聚類，可以觀察到兩組數(shù)據(jù)組間序列差異明顯、組內(nèi)序列具有相似性，分類明確，說明降脂輕身方對高脂血癥模型的調(diào)節(jié)作用顯著；Y 軸上相鄰的差異基因被聚為一類，其生物序列相近、功能以及生物特性具有相似性。聚類的結(jié)果可以為相關(guān)基因功能分析提供支持，從而為明確該藥物發(fā)揮調(diào)節(jié)高脂血癥的分子機制提供依據(jù)。

經(jīng)GO 分析發(fā)現(xiàn)，給藥組與模型組的差異基因在細(xì)胞器中涉及到RNA 剪接、mRNA 代謝等核酸代謝以及細(xì)胞大分子代謝的過程中發(fā)揮RNA 結(jié)合、有機環(huán)狀化合物以及雜環(huán)化合物結(jié)合等分子功能；在KEGG 生物途徑富集分析中，RIG-I 樣受體、p53、ErbB、mTOR 和Hippo 信號通路被顯著性富集。有研究表明：抑制Hippo 信號通路可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞的分化、增殖、凋亡發(fā)生發(fā)展［12］，而Hippo 通路的末端效應(yīng)器通過抑制YAP-SREBP 復(fù)合物的功能，對肝細(xì)胞脂肪生成產(chǎn)生負(fù)作用［13-14］。有文獻(xiàn)報道［15］，Hippo 信號途徑的功能障礙誘導(dǎo)肝細(xì)胞中單酰甘油脂肪酶（Monoacylglycerol lipase，MAGL）的過表達(dá)，MAGL 則是通過脂肪酸氧化參與脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶。這與我們的研究結(jié)果近似，在降脂輕身方的作用下，差異基因顯著富集出Hippo 信號通路，提示通過Hippo 信號通路可能是該方起到治療高脂血癥作用的靶點之一。

圖3 GO 分析

lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)是分析lncRNA 功能和調(diào)控機制的重要方式，提示我們聚為一類的基因通過共表達(dá)在基因轉(zhuǎn)錄中受到相似的調(diào)控。本研究中g(shù)i ｜755474360 等十個lncRNA 在降脂輕身方的作用下，通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著多個mRNA 的表達(dá)，從而發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

lncRNA 通過調(diào)控靶基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性等多種方式影響其靶基因的表達(dá)［16］。本研究通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對lncRNA 所對應(yīng)的靶基進(jìn)行功生物功能分析，得到以下結(jié)果：在細(xì)胞核以及胞質(zhì)內(nèi)ri ｜G370004A16 ｜ FL00003K09 ｜3994 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 模板化生物進(jìn)程，發(fā)揮金屬離子結(jié)合的功能；在細(xì)胞核中ri ｜6330564D18 ｜ PX00044K21 ｜1545 參與轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 模板化等生物進(jìn)程，執(zhí)行金屬離子結(jié)合與核酸結(jié)合功能；NONMMUT054817 在細(xì)胞核中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 模板化生物進(jìn)程；NONMMUT024722 在細(xì)胞核中參與轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 模板化、DNA 修復(fù)蛋白去泛素化以及運輸?shù)壬镞M(jìn)程，執(zhí)行聚（A）RNA 結(jié)合、金屬離子結(jié)合、核酸結(jié)合、鋅離子結(jié)合、巰基依賴泛素水解酶活性、巰基依賴泛素特異性蛋白酶活性等分子功能。有研究報道［17］：大鼠肝臟中銅和鐵離子發(fā)揮抗氧化劑的作用抑制呼吸并增加自由基介導(dǎo)的線粒體磷脂過氧化；二氯化鈷誘發(fā)急性化學(xué)缺氧可加重非酒精脂肪肝小鼠的肝臟損傷；肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子代謝失衡使得產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，可能是缺氧誘導(dǎo)脂類代謝障礙的調(diào)控途徑。提示我們在降脂輕身方的作用下，ri ｜G370004A16 等lncRNA 分別在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中通過參與金屬離子（例如鋅、鈣）結(jié)合、核酸結(jié)合等過程發(fā)揮對mRNA 轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而調(diào)控著脂質(zhì)代謝的生理作用。

圖4 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 靶基因預(yù)測

綜上所述，通過對lncRNA 與mRNA 表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn)，降脂輕身方對肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用明確。其分子機制可能通過Hippo 等信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及l(fā)ncRNAmRNA 分子網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮其調(diào)節(jié)脂代謝作用；gi ｜755474360等共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA 可能發(fā)揮了調(diào)控mRNA 的作用從而調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝；NONMMUT024722 等靶基因可能通過參與金屬離子結(jié)合、核酸結(jié)合等方式來發(fā)揮對mRNA 轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而參與肝臟脂質(zhì)代謝。