陳佳權(quán)，趙 歡，武曉萌，尹洪麗，艾恒玲?

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江牡丹江 157000；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科，黑龍江牡丹江 157000；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院婦科，上海 200030）

和厚樸酚（Honokiol）是一種從木蘭屬植物的葉和樹皮中分離得到的酚類天然化合物，其對多種癌癥均具有治療作用而被廣泛研究［1-2］。自古至今，大量研究報道，和厚樸酚在宮頸癌中具有治療作用［3］，但是其治療作用的機(jī)制尚未完全明白。血小板反應(yīng)蛋白2（Thrombospondin-2，THBS2）在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［4］，其中包括宮頸癌。但是，和厚樸酚在宮頸癌中的作用與THBS2 的關(guān)系尚未清楚。黏著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）為是生長因子受體和整合素介導(dǎo)的信號的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過其激酶活性調(diào)控正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的基本過程［5］。FAK的表達(dá)和活性增加發(fā)生在許多原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥中，并且與較差的臨床預(yù)后相關(guān)［6］。但是，和厚樸酚、THBS2 在宮頸癌中的作用是否與該通路相關(guān)，尚未有研究報道。本研究擬以宮頸癌細(xì)胞siha 為研究對象，觀察和厚樸酚、THBS2 對其增殖、遷移和侵襲的影響，揭示其作用機(jī)制與FAK 信號通路相關(guān)，為和厚樸酚作為抗癌藥的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞siha 購自美國ATCC 公司（BNCC252935）；和厚樸酚（99.9%）購自西安昊軒公司（批號20170203）；DMEM 培養(yǎng)基（批號20150523）、胎牛血清（批號20150521）、MTT（批號20150623）、胰蛋白酶（批號20150712）均購自美國Sellect 公司；LipofectamineTM2000（批號20160103）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號20160206）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號20160305）購自大連Takara 公司；SDS-PAGE 試劑盒（P0012A）、ECL 發(fā)光液（批號20160405）和RIPA 蛋白裂解液（批號20160412）均購自碧云天生物技術(shù)公司；Matrigel 基質(zhì)膠（批號20151203）、Transwell 小室（批號20151105）購自美國Corning 公司；兔抗人 THBS2（sc-133061）、FAK（sc-271126）、MMP-9（sc-21736）抗體購自美國Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（ab171522）購自美國Abcam 公司；Trizol 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（批號20161002）；反轉(zhuǎn)錄（批號20160926）與實時熒光定量PCR 試劑盒（批號20160815）購自北京天根生化科技有限公司。凝膠電泳儀器DYCZ-24DN 購自北京海天友誠科技有限公司；Molecular Devices 酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；X71 倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；7500 型熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將宮頸癌細(xì)胞siha 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3 的比例更換培養(yǎng)基，每2 d 傳代一次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將和厚樸酚（5、10、15 μg／mL）處理siha 細(xì)胞48 h 分別標(biāo)記為5 μg／mL 組、10 μg／mL組、15 μg／mL 組。將正常培養(yǎng)的siha 細(xì)胞標(biāo)記為對照組。將pcDNA 組（轉(zhuǎn)染pcDNA）、pcDNA-THBS2 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-THBS2）、和厚樸酚+pcDNA 組（轉(zhuǎn)染pcDNA并用和厚樸酚處理）、和厚樸酚+pcDNA-FAK 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-FAK 并用和厚樸酚處理），用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染至siha 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h 后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)試驗。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測THBS2、FAK mRNA 表達(dá) 收集對照組、5 μg／mL 組、10 μg／mL組、15 μg／mL 組、pcDNA 組、pcDNA-THBS2 組siha 細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。THBS2 正向引物5′-ACTGCCAGCTCCTCTTCAAT-3′，反向引物5′-CATCAATGTCCACGGAGCAG-3′；FAK 正向引物5′-CACGGAATCATGCCAGACAG-3′，反向引物5′-TCATCAACCA CTGGCTGTC T-3′；GAPDH 正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTG ATG GGATT-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 實驗，參照實時熒光定量PCR 試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 次循環(huán)，THBS2、FAK 均以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算THBS2、FAK mRNA 相對表達(dá)量。

1.2.4 MTT 法檢測細(xì)胞抑制率 取適量“1.2.2”項下各組細(xì)胞，加入20 μL 5 g／L MTT 溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO 振蕩使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度（A）。細(xì)胞抑制率＝ ［1-A490樣品／A490對照］×100%。

1.2.5 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移和侵襲 將Transwell 小室置于孔上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡30 min。然后將各組細(xì)胞消化，用純RPMI 1640 培養(yǎng)基配制成5×105／mL 細(xì)胞懸液。每個小室加入200 μL 細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個。每組設(shè)置3 個復(fù)孔，將24 孔板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出上腔，棉簽擦去上室膜上未遷移的細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，甲醇固定30 min，自然晾干后用1 g／L 結(jié)晶紫染液染色20 min，棄染液，雙蒸水洗2 次，取出后于倒置顯微鏡下觀察拍照（400 倍），計數(shù)上、下、左、右、中5 個視野的總細(xì)胞數(shù)取平均值。

將轉(zhuǎn)染成功的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行Transwell 侵襲實驗?；|(zhì)膠和培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋后（60 μL）鋪于培養(yǎng)小室上，風(fēng)干后備用，其他步驟同Transwell 體外遷移實驗。

1.2.6 Western blot 檢測細(xì)胞中THBS2、FAK、MMP-9 蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r／min 離心10 min，取上清置于EP 管中，加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮沸10 min，電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃處理2 h，加發(fā)光液曝光。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞的抑制作用 如表1 所示，與對照組比較，10、15 μg／mL 組siha 細(xì)胞的抑制率均升高（P＜0.05）。

表1 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞抑制率的影響（， n＝9）

表1 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞抑制率的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

2.2 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響 如圖1、表2 所示，與對照組比較，和厚樸酚10、15 μg／mL 組siha 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，MMP-9 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。

圖1 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響

表2 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響（， n＝9）

表2 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

2.3 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞中THBS2 表達(dá)的影響 如圖2、表3 所示，與對照組比較，和厚樸酚10、15 μg／mL 組siha 細(xì)胞中THBS2 mRNA 和蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

圖2 和厚樸酚處理的宮頸癌細(xì)胞中THBS2 的蛋白表達(dá)

表3 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞中THBS2 表達(dá)的影響（，n＝9）

表3 和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞中THBS2 表達(dá)的影響（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

2.4 過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞增殖遷移侵襲的影響 如圖3、表4 所示，與pcDNA 組比較，pcDNA-THBS2 組siha細(xì)胞的抑制率升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低，MMP-9 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖3 過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響

表4 過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞增殖遷移侵襲的影響（， n＝9）

表4 過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞增殖遷移侵襲的影響（， n＝9）

注：與pcDNA 組比較，?P＜0.05。

圖4 和厚樸酚處理、過表達(dá)THBS2 的宮頸癌細(xì)胞中THBS2、FAK 的蛋白表達(dá)

2.5 和厚樸酚、過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞中FAK 信號通路的影響 用10 μg／mL 和厚樸酚處理后的siha 細(xì)胞標(biāo)記為honokiol 組。如圖4、表5 所示，與對照組比較，honokiol 組siha 細(xì)胞中THBS2 蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)AK mRNA、蛋白表達(dá)均升高；與pcDNA 組比較，pcDNA-THBS2 組siha細(xì)胞中THBS2 蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)AK mRNA 和蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

表5 和厚樸酚、過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞中FAK 信號通路的影響（， n＝9）

表5 和厚樸酚、過表達(dá)THBS2 對宮頸癌細(xì)胞中FAK 信號通路的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0. 05；與pcDNA 組比較，#P＜0.05。

2.6 過表達(dá)FAK 逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞增殖遷移侵襲的抑制作用 如圖5、表6 所示，與和厚樸酚+pcDNA 組比較，和厚樸酚+pcDNA-FAK 組siha 細(xì)胞中FAK、MMP-9的蛋白表達(dá)均升高，THBS2 蛋白表達(dá)、細(xì)胞抑制率降低，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均升高（P＜0.05）。

圖5 過表達(dá)FAK 逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用

表6 過表達(dá)FAK 逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用（， n＝9）

表6 過表達(dá)FAK 逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用（， n＝9）

注：與和厚樸酚+pcDNA 組比較，?P＜0.05。

3 討論

和厚樸酚是中國傳統(tǒng)藥物厚樸中分離的化學(xué)式為C18H18O2的一種化合物，其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化的功效［7-8］。和厚樸酚在腫瘤中的功能及機(jī)制研究受到關(guān)注。Banik 等［9］報道，和厚樸酚可有效地預(yù)防多種腫瘤的生長，如乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等。最近的研究表明，這種植物化學(xué)物質(zhì)可調(diào)節(jié)各種分子靶點，其可單獨使用或與其他化學(xué)治療藥物組合用于預(yù)防和治療癌癥。自古至今，大量研究報道，和厚樸酚在宮頸癌中具有治療作用［10］。和厚樸酚在宮頸癌中的作用機(jī)制有調(diào)控miRNA、p38 信號通路［11］。本研究運用MTT 法、Transwell法檢測了和厚樸酚治療的宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚可呈濃度依賴性抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，最適濃度為10 μg／mL，這些結(jié)果均與前人所作的實驗結(jié)果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚可上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中THBS2 的表達(dá)，這是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚的作用機(jī)制可能與調(diào)控THBS2 的表達(dá)相關(guān)，這為和厚樸酚的臨床治療的應(yīng)用提供了理論參考。

THBS2 在多種晚期癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)，尤其宮頸癌。Zhou 等［12］在研究中報道，THBS2 在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，且其為miR-20a 的靶標(biāo)，THBS2 的敲減可消除宮頸癌細(xì)胞中miR-20a 抑制劑介導(dǎo)的抗增殖、促凋亡和抗自噬作用。Wei 等［13］、Wu 等［14］在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，THBS2 可被miR-221-3p 直接靶向負(fù)調(diào)控，進(jìn)而參與宮頸癌或?qū)m頸鱗癌的轉(zhuǎn)移和血管生成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THBS2 在和厚樸酚治療的宮頸癌細(xì)胞中表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，并且過表達(dá)THBS2 具有與和厚樸酚相同的抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，這說明THBS2 在宮頸癌中具有抑制癌癥進(jìn)一步惡化的作用，并且和厚樸酚可增強這種作用。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚或過表達(dá)THBS2均可抑制宮頸癌中FAK 信號通路的活性，推測該通路可能參與宮頸癌的惡性化進(jìn)展。

FAK 信號通路可整合多條下游信號通路，包括FAKPI3K、FAK-MAPK、FAK-GTPase、FAK-p53 等，其在腫瘤的惡性化進(jìn)展中具有重要的作用［15-16］報道，纖維連接蛋白可通過激活FAK 信號通路促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Zhou等［17］、郝臻鳳等［18］報道，F(xiàn)AK 在宮頸癌中的表達(dá)顯著升高，并與宮頸癌的分期、浸潤、轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚治療、過表達(dá)THBS2 在宮頸癌中具有相同的失活FAK 信號通路的作用，并且過表達(dá)FAK的宮頸癌細(xì)胞中，THBS2 表達(dá)明顯下調(diào)，宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均得到增強，這說明不僅和厚樸酚聯(lián)合THBS2 可失活FAK 信號通路，相反，F(xiàn)AK 信號通路也可逆向調(diào)控和厚樸酚聯(lián)合THBS2 的抗宮頸癌作用，揭示了和厚樸酚聯(lián)合THBS2 的抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用可能與失活FAK 信號通路密切相關(guān)。

綜上所述，和厚樸酚聯(lián)合THBS2 可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與失活FAK 信號通路有關(guān)，為和厚樸酚用于宮頸癌的治療提供更多依據(jù)。