陳發(fā)菊 彭 梅 王 麗楊 艷李立郎王 瑜楊小生?

（1.貴州醫(yī)科大學藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽 550014；2.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014）

隨著人們生活水平的提高，越來越多的人習慣飲酒，但長期飲酒所致酒精性肝病的發(fā)病率和死亡率最高，患者脂肪會變性，10%～35%引發(fā)成肝炎，其中8%～20%最終轉化為肝硬化［1-5］。酒精性肝病嚴重影響人們的經(jīng)濟基礎及健康狀況，到目前為止沒有藥物能有效治療［6］。氧化應激被認為是酒精性肝病受損的主要發(fā)病機制之一［7］。

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物顯齒蛇葡萄［Ampelopsisgrossedntata（Hand-Mazz）W.T.Wang］的莖葉，主要分布于廣西、廣東、云南等各地區(qū)，其性味甘淡，具有清熱解毒功效，主治咽喉腫痛、感冒風熱、黃疸型肝炎［8］?？傸S酮是從藤茶莖葉中提取的有效成分，具有抗血栓、降脂、保肝、降血糖等作用［9-12］。有研究報道，藤茶總黃酮對小鼠的拘束負荷引起的肝損傷、免疫性肝損傷及四氯化碳致急性肝損傷有保護作用，但尚未見對酒精性肝損傷有保護作用。本研究旨在通過藤茶總黃酮對酒精性小鼠肝組織病理損傷的影響，觀察其對酒精性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藤茶總黃酮制備 藤茶來源于貴州省銅仁市梵凈山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學孫慶文教授鑒定為正品。取藥材嫩葉干燥粗粉90 g，1 899 mL 75%乙醇加熱回流提取3 次，濾過，合并濾液，減壓濃縮，冷卻后低溫放置3 d 使其充分析出沉淀，收集沉淀并反復重結晶，即得（8 g），得率為8.9%。

1.2 動物 雄性KM 小鼠，體質量（25±5）g，購于重慶騰鑫生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（軍）2012-0011，飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（55±5）%的清潔級動物房，控制照明時間為每天12 h，自由進食與飲水。

1.3 試劑 習酒購于貴陽沃爾瑪超市（批號750813602S）。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，批號20180429）；T-AOC（南京建成生物工程研究所，批號20171218）；ALT（南京建成生物工程研究所，批號20180216）；AST（南京建成生物工程研究所，批號20180416）；SOD（南京建成生物工程研究所，批號20180521）；GSH（南京建成生物工程研究所，批號20180711）；IL-4（南京建成生物工程研究所，批號20180226）；IL-6（南京建成生物工程研究所，批號20180714）；TNF-α（南京建成生物工程研究所，批號20180424）。

1.4 儀器 TP1020 自動阻止脫水機、包埋機、CM2245 輪轉式石蠟切片機、光學顯微鏡（德國Leica 公司）；電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；W-80A 型漩渦混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；電子天平（賽多利斯電子公司）；Milli QA 純水處理器（法國Millipo Trading 公司）；電熱鼓風干燥機（上海博訊實業(yè)公司）；離心機（德國Eppendorf 公司）；-80 ℃低溫冰箱（日本三洋公司）；酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；光學顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.5 分組及給藥 將50 只小鼠隨機分為空白組，模型組及藤茶總黃酮低、中、高（50、75、100 mg／kg）給藥組，每組10 只，除正常組外各組按16 mL／kg 劑量灌胃56%白酒，每天1 次，灌酒1 h 后給藥組大鼠灌胃給予相應藥物，空白組、模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)21 d。

1.6 HE 染色 將末次灌胃結束后禁食24 h 的小鼠頸椎脫臼處死，取右葉肝臟組織，切成1 cm×1 cm，顯微鏡觀察其病理情況，并拍照記錄。

1.7 肝組織ALT、AST、SOD、MDA、GSH、T-AOC、IL-4、IL-6、TNF-α 檢測 灌胃給藥后，小鼠頸椎脫臼處死，取肝組織稱定質量，加入9 倍量生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿后2 500 r／min 離心10 min，取上清液待測。

1.8 統(tǒng)計學分析 通過SPSS13.0 軟件進行處理，結果以（）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響 各組小鼠死亡率見表1。死亡的小鼠均為灌胃后第2 天發(fā)現(xiàn)，解剖時未發(fā)現(xiàn)胸腔有淤血或胃穿孔，但胃里有大量液體，大腸內有大量氣體而無食物存在，死前均表現(xiàn)步履蹣跚、抽搐、煩躁、肚子脹氣等現(xiàn)象。

表1 藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響（， n＝10）

表1 藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響（， n＝10）

2.2 藤茶總黃酮對小鼠肝組織ALT、AST、SOD、MDA、GSH、T-AOC 的影響 如圖1 所示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織ALT、AST、MDA 水平升高（P＜0.05），而SOD、GSH、T-AOC 活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮各劑量組小鼠肝組織ALT、AST、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD、GSH、T-AOC 活性升高，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

圖1 藤茶總黃酮對小鼠肝組織ALT（A）、AST（B）、SOD（C）、MDA（D）、GSH（E）、T-AOC（F）的影響

2.3 藤茶總黃酮對小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影響 如表2 所示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮各劑量組顯示肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。

表2 藤茶總黃酮對小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影響（， n＝4）

表2 藤茶總黃酮對小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影響（， n＝4）

注：與空白組比較，?P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05。

2.4 藤茶總黃酮對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響 如圖2 所示，空白組顯示肝組織結構正常，肝細胞排列整齊、結構清晰，無水腫現(xiàn)象及炎性細胞；模型組小鼠肝組織結構、肝細胞排列紊亂，大多數(shù)肝細胞呈水腫現(xiàn)象，炎癥細胞浸潤，肝細胞纖維化，肝組織中有大小不一的脂肪滴空泡；藤茶總黃酮低劑量、中劑量組小鼠肝組織結構、肝細胞排列較整齊，肝細胞水腫現(xiàn)象、肝組織內炎性細胞、脂肪滴空泡較模型組有所減輕；藤茶總黃酮高劑量組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞排列整齊、大小均一，炎性細胞、脂肪滴空泡較模型組顯著減輕。

圖2 各組小鼠肝組織病理形態(tài)（×200）

3 討論

本實驗采用習酒對昆明種小鼠按體質量進行灌胃制成酒精性肝損傷的模型，觀察藤茶總黃酮對肝臟的保護作用。酒精性肝損傷的組織學特征主要包括肝細胞脂肪滴空泡的積累、脂肪肝（脂肪變性和炎性細胞）及肝硬化［13-14］。通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，本實驗模型組小鼠的肝組織發(fā)現(xiàn)有大量炎性細胞和脂肪滴空泡，藤茶總黃酮給藥后此現(xiàn)象顯著減輕，提示藤茶總黃酮可能對肝臟具有保護作用。

轉氨酶參與肝臟的整個過程，肝臟出現(xiàn)問題的一個重要標志是轉氨酶升高。ALT 主要存在于肝細胞漿，AST 主要存在于肝細胞的線粒體內，肝細胞最敏感的兩種酶是ALT 和AST，肝細胞受損時ALT 和AST 的活性升高，能夠反映肝細胞受損的程度的大學［15］。本實驗結果顯示模型組ALT 及AST 的活性較高，藤茶總黃酮給藥后活性降低。體內自由基能通過內源性抗氧化物酶SOD 和GSH 清除，MDA是一個通過自由基誘導的重要脂質過氧化產(chǎn)物被用作氧化應激的生物標記，組織中MDA 水平越高，氧化活性越強，組織受損程度越大［16］。脂質過氧化的主要降解產(chǎn)物MDA可嚴重損傷肝細胞的細胞膜結構，導致肝細胞的腫脹、壞死。T-AOC 是機體內抗氧化力量的總體體現(xiàn)，是機體對抗氧自由基的主要體系［17］。機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在密切聯(lián)系，該防御體系有酶促與非酶促兩個體系。本實驗結果顯示藤茶總黃酮給藥后SOD、GSH和T-AOC 的活性明顯的活性明顯強與模型組，MDA 水平低于模型組。

炎癥因子參與肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展整過過程，TNF-α是由機體單核巨噬細胞等多種免疫細胞所產(chǎn)生的具有重要生物活性的細胞因子，參與炎癥反應、免疫調節(jié)、細胞周期、細胞活性和細胞凋亡等［18］，因此TNF-α 表達水平的高低可以反映肝細胞損傷程度及炎癥反應程度的大?。?9］。IL-4細胞因子具有多種生物學功能，可調節(jié)T、B 淋巴細胞分化、活化過程，并可促進Th2 細胞的免疫應答。IL-6 參與機體的免疫應答及炎癥反應，可通過刺激細胞生長和細胞外基質增生，導致肝上皮細胞變化，IL-6 被認為是肝臟疾病炎癥的一個重要因素［20］。本實驗結果顯示模型組肝組織IL-4、IL-6 及TNF-α 水平明顯升高，藤茶總黃酮給藥后肝組織IL-4、IL-6 及TNF-α 水平降低。

綜上所述，藤茶總黃酮對肝臟具有保護作用，其可能機制與增加肝組織抗氧化酶的活性、降低脂質過氧化水平、降低IL-4、IL-6 及TNF-α 等炎癥因子水平有關。