田金娜，陳 迪，李建保?，王 霞，李藍(lán)軒，劉智龍

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，四川成都 610072；2.新津區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川成都 611430；3.遂寧市第一人民醫(yī)院，四川遂寧 629000；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610075）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，并隨病程的延長產(chǎn)生不可逆性氣道狹窄和氣道重塑，故氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個主要病理學(xué)特征［1-2］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4 是發(fā)展慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而Th1 細(xì)胞因子IFN-γ 在輕度至中度哮喘患者中阻止這一過程［3］。HMGB1 是一種核蛋白，在組織損傷、感染或炎癥時，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，然后釋放到細(xì)胞外空間調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)［4-9］。有學(xué)者認(rèn)為TGF-β1 是氣道重塑的主要中介［10-11］，促使成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致過多的膠原蛋白積聚和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［12］，具有強(qiáng)烈的致纖維化作用。α-SMA 的表達(dá)表明成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)信號的來源，包括膠原蛋白和纖維連接蛋白［13］。本研究建立哮喘氣道重塑模型，以丹龍定喘湯及醋酸潑尼松進(jìn)行干預(yù)，對肺組織中HMGB1、α-SMA、IL-4、IFN-γ 和TGF-β1 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，以探討丹龍定喘湯防治哮喘氣道重塑的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性BALB／c 小鼠180 只，體質(zhì)量18～20 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2015-030。

1.2 藥物 丹龍定喘湯由丹參10 g、地龍10 g、當(dāng)歸10 g、熟地黃10 g、炙黃芪10 g、法半夏10 g、陳皮10 g、茯苓10 g、紫菀10 g、白芍藥10 g、炙甘草6 g 組成，所有藥物均從成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科一次性購齊并鑒定，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室根據(jù)其組方比例，采用水煎醇沉法制備原方提取液，真空旋蒸濃縮至1 mL 含生藥1 g。醋酸潑尼松片（5 mg／片，批號388001）購自重慶科瑞制藥（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，配制成0.42 g／L 混懸液。

1.3 試劑 卵蛋白（OVA，批號A5253-500G，美國Sigma-Aldrich 公司）；ABC-ELISA 法免疫組化檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；二抗Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（貨號111-035-003）、Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（貨號115-035-003）（美國Jackson 公司）；一抗Anti-HMGB1抗體-ChIPGrade（貨號ab18256）、Anti-α smooth muscle Actin 抗體（貨號ab5694）、內(nèi)參抗體GAPDH（HyTest Ltd，貨號5G4）（英國Abcam 公司）；改良Western 及IP 細(xì)胞裂解液（貨號WB007）、BCA 蛋白定量試劑盒（貨號WB101）（上海西唐生物技術(shù)有限公司）；底物發(fā)光液、immobilon western chemilum hrpsubstrate（貨號WBKLS0500）、0.45 μm immobilon-P transfer membrane（貨號IPVH00010）（美國Millipore 公司）；HE 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0105）。

1.4 儀器 ASP300S 全自動真空組織脫水機(jī)、EG1150C 分體式石蠟包埋機(jī)、RM2235 石蠟切片機(jī)、AutoStainer XL 自動染色機(jī)（德國Leica 公司）；PYX-DHS 數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；TGL-16B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；移液槍（美國Thermo labsystems 公司）；XW-80A 漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；EPS-600 電泳儀（上海天能科技有限公司）；VE180A 微型垂直電泳槽（上海天能科技有限公司）；VE186 轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）；Clinx ChemiScope 系列熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組及造模 將180 只小鼠在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為6 組，即空白對照組、模型組、強(qiáng)的松組、丹龍定喘湯高劑量組、丹龍定喘湯中劑量組、丹龍定喘湯低劑量組，每組30 只。參照文獻(xiàn)造模方法［14-15］，除空白對照組外其余各組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、14 天均用0.2 mL 抗原液（含卵蛋白100 μg、氫氧化鋁干粉1 mg）腹腔注射致敏。第28天開始，小鼠給予1% OVA 溶液進(jìn)行霧化吸入，連續(xù)5 d，每天30 min／次。第35 天開始霧化吸入激發(fā)哮喘，每周霧化3 次，共6 周。空白對照組以生理鹽水代替。

2.2 給藥 于實(shí)驗(yàn)第35 天開始灌胃給藥，于每日激發(fā)前半小時，空白對照組和模型組均給予0.9% 生理鹽水（10 mL／kg），強(qiáng)的松組給予醋酸潑尼松（13.86 mg／kg），丹龍定喘湯高、中、低劑量組用藥劑量按照人和動物體表面積比進(jìn)行換算（計(jì)算公式來源于施新猷著《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》 ），分別按生藥量39.84、26.56、13.28 g／kg 給藥，連續(xù)給藥42 d。

2.3 標(biāo)本采集及病理、免疫組化檢測 藥物干預(yù)后的第42 天隨機(jī)抽取各組6 只小鼠，均取右肺上中肺葉放入經(jīng)DEPC 水處理的4% 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚的切片，烤片后行HE 染色，觀察肺組織病理變化。第42 d 隨機(jī)抽取各組10 只小鼠，采集肺組織，參照ELISA法進(jìn)行免疫組化檢測。采用Img-Pro6.0 圖像分析系統(tǒng)，每張切片在200 倍顯微鏡下觀察，以染色后細(xì)胞呈棕黃色為陽性表達(dá)，隨機(jī)選取5 個視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的平均光密度值，通過標(biāo)準(zhǔn)品的已知濃度和OD值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，對應(yīng)擬合公式（y＝a+bx+cx2+dx3，其中a、b、c、d為參數(shù)），R2為相關(guān)系數(shù)，必須大于0.99。將待測樣本的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)后求出樣本濃度，表示各組小鼠肺組織中IL-4、IFN-γ、TGF-β1 表達(dá)量。

2.4 Western blot 法檢測肺組織α-SMA、HMGB1 表達(dá) 藥物干預(yù)后的第42 天，隨機(jī)抽取各組5 只小鼠，剪取肺組織，加入改良Western 及IP 細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，離心，收集上清液即組織總蛋白。按BCA 蛋白定量試劑盒說明書將提取的蛋白樣品進(jìn)行蛋白定量。灌膠：蒸餾水清洗灌膠玻璃板，豎直晾干；配制12% 分離膠、10% 分離膠（GAPDH 用12%分離膠，目的蛋白用10%分離膠）、5%濃縮膠，并垂直插入Teflon 齒梳，室溫靜置；待膠完全聚合后拔出梳子，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，并用電泳緩沖液沖洗上樣孔以去除氣泡。電泳：制作上樣液，加熱5 min，使蛋白充分變性，冰浴驟冷，3 000 r／min 離心1 min；每孔加上樣液15 μL（20 μg 總蛋白），留一孔加5 μL預(yù)染蛋白Marker，80 V 恒壓電泳約20 min，當(dāng)指示劑溴酚蘭進(jìn)入分離膠后改用110 V 恒壓電泳，當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5 cm 處時關(guān)閉電源，取出膠板；轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測：PVDF 膜浸泡在甲醇中15 s，重蒸水漂洗2 min，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5 min 后開始后續(xù)操作；剝離凝膠，修膠后將膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min；制作轉(zhuǎn)膜；300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h；放入5% BSA 室溫封閉2 h；TBST 洗膜5 min，共3 次；加入TBST 稀釋的相應(yīng)一抗稀釋液GAPDH（1∶ 1 000）、α-SMA（1 μg／mL），HMGB1（1 μg／mL），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜5 min，共3 次，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液（1∶10 000）室溫孵育2 h；TBST 洗膜10 min，共3 次。膜于ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑（試劑A∶試劑B ＝1∶1）反應(yīng)2 min，暗室中用X 膠片感光、顯影、定影。采用Clinx ChemiScope 系列熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，進(jìn)行圖像采集和OD值分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊用Games-Howell 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織病理學(xué)變化 空白對照組小鼠支氣管結(jié)構(gòu)正常，氣道上皮完整，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，而其余各組小鼠支氣管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度病理形態(tài)學(xué)改變。其中，模型組小鼠氣道壁增厚，管腔變窄，氣道黏膜皺襞增多，上皮細(xì)胞脫落、壞死，平滑肌痙攣，氣道平滑肌層及基底膜增厚，黏膜下及管壁大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤；強(qiáng)的松組、丹龍定喘湯各劑量組小鼠病理變化較輕。

各組小鼠肺組織非特異性炎癥程度依次為模型組＞強(qiáng)的松組≈丹龍定喘湯高劑量組＞丹龍定喘湯低劑量組≈丹龍定喘湯中劑量組＞空白對照組。用藥42 d 時，模型組肺小鼠組織表現(xiàn)出明顯的炎細(xì)胞浸潤及纖維增生等一系列病理改變，以中性粒細(xì)胞性炎癥為主，表明氣道重塑造模成功；各給藥組小鼠氣道炎癥及氣道重塑程度明顯減輕，表明丹龍定喘湯可有效改善哮喘氣道重塑，并且中、低劑量組更顯著，可能與中藥復(fù)方代謝動力學(xué)有關(guān)。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，200×）

3.2 丹龍定喘湯對小鼠肺組織IL-4、IFN-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織IL-4、TGF-β1 表達(dá)升高（P＜0.01），IFN-γ 表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，強(qiáng)的松組及丹龍定喘湯低劑量組小鼠肺組織IL-4、TGF-β1 表達(dá)降低（P＜0.01），強(qiáng)的松組及丹龍定喘湯中、低劑量組小鼠肺組織IFN-γ 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 丹龍定喘湯對肺組織IL-4、IFN-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響（ng／mL，， n＝10）

表1 丹龍定喘湯對肺組織IL-4、IFN-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響（ng／mL，， n＝10）

注：與空白對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0. 01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 丹龍定喘湯對小鼠肺組織HMGB1、α-SMA 表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織HMGB1 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹龍定喘湯中劑量組小鼠肺組織α-SMA 表達(dá)降低（P＜0.05），強(qiáng)的松組及丹龍定喘湯中、低劑量組小鼠肺組織HMGB1 表達(dá)降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

4 討論

哮喘氣道重塑主要表現(xiàn)為上皮下纖維化伴基底膜增厚、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞聚集、纖維生長因子分泌增加、近端氣道上皮下細(xì)胞外基質(zhì)沉積、氣道平滑肌增厚、杯狀細(xì)胞增生、血管再生等一系列復(fù)雜改變［16-18］。來源于Th2 的細(xì)胞因子IL-4，能夠誘導(dǎo)釋放促嗜酸性粒細(xì)胞聚集的細(xì)胞因子和促炎因子［19］，加速平滑肌細(xì)胞增殖，也可刺激呼吸道上皮細(xì)胞分泌TGF-β1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化并合成膠原，導(dǎo)致呼吸道重構(gòu)［20］。IFN-γ 主要來源于Th1 細(xì)胞，是IL-4 的拮抗子，調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的活化、分化和募集作用；同時抑制IgE 生成，促進(jìn)IgG 合成，從而引起支氣管擴(kuò)張。先前的研究發(fā)現(xiàn)了HMGB1 在過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展中的起著至關(guān)重要的上游作用［21］。HMGB1 對Th2 反應(yīng)具有上調(diào)作用，增加包括IL-4在內(nèi)的Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生，另外減弱一些Th1 細(xì)胞及包括IFN-γ 在內(nèi)的Th2 細(xì)胞因子的表達(dá)［18］。TGF-β1 由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌，在哮喘的發(fā)病過程中具有抗炎、促炎雙重作用，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長，具有強(qiáng)力的致纖維化作用，當(dāng)氣道反復(fù)受到抗原刺激或出現(xiàn)慢性炎癥時，TGF-β1 可通過各種途徑致使氣道平滑肌細(xì)胞增生、膠原合成、基質(zhì)沉積，最終引起組織纖維化和氣道重建［22］。

表2 丹龍定喘湯對哮喘小鼠肺組織α-SMA、HMGB1 表達(dá)的影響（g／L，， n＝5）

表2 丹龍定喘湯對哮喘小鼠肺組織α-SMA、HMGB1 表達(dá)的影響（g／L，， n＝5）

注：與空白對照組比較，ΔP＜0. 05；與模型組比較，?P＜0.05。

圖2 各組小鼠肺組織HMGB1、α-SMA 表達(dá)

氣道重塑貫穿于哮喘始終，后期多伴有肺功能損害，歸屬于中醫(yī)學(xué)“肺痿”“肺痹”“喘證”等范疇。本病首先責(zé)之于肺脾腎三臟陽氣虛損，水液代謝失常而化生痰飲；陽氣虧虛，氣不行血，血行不暢，痰瘀膠結(jié)，潛伏肺竅，日久氣道失養(yǎng)，漸致肺因痹而痿。因此，“氣虛夾痰夾瘀”是哮喘氣道重塑的主要病機(jī)。丹龍定喘湯在張景岳金水六君煎的基礎(chǔ)上加味而成，由丹參、地龍、當(dāng)歸、熟地黃、炙黃芪、法半夏、陳皮、茯苓、紫菀、白芍藥、炙甘草等藥物組成。方中以丹參、地龍活血化瘀、通絡(luò)平喘為君。法半夏、陳皮、茯苓、紫菀等藥健脾化痰、降氣平喘為臣。配以炙黃芪補(bǔ)中益氣、健脾益肺，當(dāng)歸、熟地黃、白芍滋陰養(yǎng)血，調(diào)和血脈為佐使。全方共奏益氣扶正、活血通絡(luò)、化痰平喘等功效。

研究顯示HMGB1 顯著增強(qiáng)了GATA3 及IL-4、IL-5 的分泌，但抑制肺中T-bet 的表達(dá)和IFN-γ 的分泌［23-24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OVA 致敏的哮喘模型組小鼠肺組織中HMGB1、IL-4 的表達(dá)明顯升高，但I(xiàn)FN-γ 表達(dá)明顯降低，說明HMGB1 的增加確實(shí)可以促進(jìn)IL-4 的分泌，抑制IFN-γ的表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致；丹龍定喘湯組小鼠肺組織HMGB1、IL-4 表達(dá)明顯降低，IFN-γ 表達(dá)明顯升高，說明丹龍定喘湯可以直接通過抑制小鼠肺組織中IL-4 的表達(dá)、促進(jìn)IFN-γ 的分泌，或間接通過減少HMGB1 的分泌而減輕氣道炎性反應(yīng)。基于IL-4 和IL-5 在促進(jìn)氣道過敏性嗜酸性粒細(xì)胞炎癥中的重要作用［25］，有研究認(rèn)為HMGB1 可能通過誘導(dǎo)Th2 型反應(yīng)的優(yōu)勢而加重急性過敏性哮喘的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥［22］；另有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 還可以促進(jìn)氣道中的中性粒細(xì)胞炎癥［26］，而氣道中的中性粒細(xì)胞炎癥與哮喘的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［27-29］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組哮喘模型小鼠肺組織以中性粒細(xì)胞性炎癥為主，似乎與IL-4／IFN-γ引起嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的結(jié)論相悖，但本實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹龍定喘湯仍然可以減輕哮喘模型小鼠肺組織炎性反應(yīng)，可能與其他促中性粒細(xì)胞性細(xì)胞因子，如：IL-6、IL-8、IL-1β 在肺組織中的表達(dá)增多，而丹龍定喘湯可以抑制這類細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。Elliot 等［30］的最新研究證實(shí)，氣道炎癥或其他刺激都可以誘導(dǎo)氣道重塑，但在少粒細(xì)胞性哮喘中，重塑包括氣道平滑肌和網(wǎng)狀基底膜層的厚度增加；而在粒細(xì)胞性哮喘中，重塑還包括氣道壁厚度增加及由于氣道平滑肌縮短和黏液阻塞所致的氣道狹窄。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組哮喘模型小鼠肺組織除了平滑肌和網(wǎng)狀基底膜層的厚度增加外，還表現(xiàn)出氣道平滑肌和網(wǎng)狀基底膜層的厚度增加及氣道狹窄，與上述研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)研究證明，丹龍定喘湯以其“益氣扶正、活血通絡(luò)、化痰平喘”之功，丹龍定喘湯抑制肺組織中IL-4 釋放，減少HMGB1 的表達(dá)，促進(jìn)IFN-γ 的分泌，調(diào)節(jié)IL-4／IFN-γ 失衡，使Th1／Th2 趨向平衡，減少炎癥因子釋放，減輕氣道炎性反應(yīng)；降低肺組織中TGF-β1 及α-SMA 的水平，減少氣道膠原及基質(zhì)沉積，減輕氣道纖維化，從而改善氣道重塑。