王京龍，于定榮，張 超，王英姿，孫秀梅，張兆旺

（1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東棗莊 277160；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250355；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，北京 100029）

二黃湯源于《醫(yī)宗金鑒》，由黃芩、黃連、甘草組成，是清熱解毒的常用方劑［1］。研究表明，方中黃酮、生物堿、三萜是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，藥理作用集中在抗病原微生物［2-3］、解熱［4-5］、抗炎［6-7］等方面。

半仿生-酶法在半仿生法［8］的基礎(chǔ)上引入生物酶提取技術(shù)，是后者進一步“仿生化”設(shè)計，首先選擇適宜的生物復(fù)合酶對中藥進行預(yù)處理，再按半仿生法于第一煎、第三煎溶劑中加入適宜消化酶，在優(yōu)選溫度下進行提取，所得活性混合物更有利于胃腸吸收。該方法被廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方提取中［9-11］，與傳統(tǒng)水提法和醇提法相比，它在活性成分提取效率［12-13］、藥效作用［14-15］方面具有一定優(yōu)勢。

課題組前期分別優(yōu)化了二黃湯3 種提取工藝［16-17］，但給藥后提取物體內(nèi)吸收情況尚不明確。因此，本實驗采用HPLC-MS／MS 法［18］測定3 種提取方法下二黃湯中甘草苷、黃芩苷、巴馬汀、小檗堿、甘草次酸在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，比較不同提取液藥動學(xué)差異，以期為相關(guān)現(xiàn)代制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 系列高效液相色譜儀，配置Agilent 6410 三重串聯(lián)四極桿LC／MS 系統(tǒng)（Triple Quad LCMS System）、電噴霧電離源（ESI）（美國Agilent 公司）；EVA50A 氮吹儀（北京普利泰科儀器有限公司）；CEN-TRIFUGE-5424R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；VX-200 渦旋混合儀（美國Labnet 公司）；XS105DZ 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DH-系列中空纖維超濾膜（上海德宏生物醫(yī)學(xué)科學(xué)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑

1.2.1 半仿生-酶提取液、半仿生提取液制備 按照課題組前期報道的方法制備［16］，濃縮，即得（每1 mL 相當(dāng)于處方藥材1 g）。

1.2.2 醇提液制備 采用比例分割法［19］。優(yōu)選最佳醇提體積分數(shù)為55%，在藥材粒度、提取次數(shù)、提取時間、過濾、濃縮等條件與半仿生法相同的條件下制備，濃縮，即得（每1 mL 相當(dāng)于處方藥材1 g）。

1.3 藥物 甲醇、乙腈為色譜純（Merck 公司）；乙酸銨、甲酸為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

1.4 動物 雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20140007。

2 方法

2.1 HPLC-MS／MS 條件

2.1.1 色譜 Inertsil ODS-SP 色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 甲酸（含10 mmol／L 乙酸銨）（B），梯度洗脫（0～6 min，20%～100% A；6～13.5 min，100% A；13.5～13.7 min，100%～20% A；13.7～20 min，20%A）；體積流量0.6 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 離子源溫度350 ℃；霧化氣體積流量10 L／min；噴霧器氣壓40 psi（1 psi ＝0.133 kPa）；離子源噴射電壓±4 500 V；電噴霧電離源，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），正負離子切換同時測定；正離子模式下，黃芩苷m／z447.2～271.1（碰撞能量25 V），黃芩素m／z271.1～123.1（碰撞能量25 V），巴馬汀m／z352.3～336.2（碰撞能量22 V），小檗堿m／z336.3～320.2（碰撞能量21 V），甘草次酸m／z471.4～189.3（碰撞能量35 V），荷葉堿（內(nèi)標(biāo)）m／z295.8～265.9（碰撞能量20 V）；負離子模式下，甘草苷m／z417.2～135.2（碰撞能量22 V），橙皮苷（內(nèi)標(biāo)）m／z608.5～608.5（碰撞能量0 V），熊果酸（內(nèi)標(biāo)）m／z455.4～455.4（碰撞能量0 V）［18］。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取黃芩苷、黃芩素、甘草苷、小檗堿、巴馬汀、甘草次酸對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制得各成分質(zhì)量濃度分別為 0.547、0.198、0.154、0.2、0.25、0.199 mg／mL 的溶液，4 ℃下冷藏備用，實驗時取適量置于10 mL 量瓶中，用“2.1.1”項下流動相稀釋，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取橙皮苷、荷葉堿、熊果酸對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制得各成分質(zhì)量濃度分別為0.147、0.17、0.174 mg／mL 的溶液，4 ℃下冷藏備用，實驗時取適量置于10 mL 量瓶中，用“2.1.1”項下流動相稀釋，即得。

2.3 給藥與樣品采集 將18 只大鼠隨機分為3 組，每組6 只，灌胃給予“1.2”項下3 種提取液（分子量≤1 000 Da），劑量均為15.0 g／kg，給藥前12 h 禁食不禁水。于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h 大鼠眼眶后靜脈叢取血各0.5 mL，肝素抗凝，4 000 r／min 離心10 min，制備空白血漿、含藥血漿，-20 ℃下冷藏備用。

2.4 血漿處理 準(zhǔn)確吸取0.2 mL 含藥血漿，加入0.1 mL 內(nèi)標(biāo)溶液、20 μL 乙酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH 至4），混勻后加入0.8 mL 甲醇渦旋2 min，沉淀蛋白，上清液在10 000 r／min 轉(zhuǎn)速下冷凍離心10 min，取上清液，用35 ℃氮氣吹干，殘渣加入0.15 mL 流動相渦旋3 min，復(fù)溶物在15 000 r／min轉(zhuǎn)速下冷凍離心10 min，取上清液。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液各0.1 mL，置于1.5 mL 離心管中，加入0.2 mL 空白血漿，按“2.4”項下方法處理。以血漿中各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），待測物、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，以S／N ＝10 計算定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

再參考課題組前期報道的方法［18］，進行精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性試驗，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果均符合生物樣品測定要求。

3.2 血藥濃度測定 精密吸取“2.3”項下含藥血漿，按“2.4”項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣測定，并繪制血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 各成分血藥濃度-時間曲線Fig.1 Plasma concentration-time curves for various constituents

3.3 主要藥動學(xué)參數(shù)比較 通過PKSolver 藥動學(xué)藥效學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件，采用非房室模型測定大鼠給藥后不同時間點血藥濃度，計算各成分主要藥動學(xué)參數(shù)，以SPSS 17.0 軟件進行t檢驗，結(jié)果見表2。

3.3.1 甘草苷 半仿生-酶提取液、半仿生提取液中tmax短于醇提液中；半仿生提取液中Cmax大于半仿生-酶提取液中（P＜0.01），AUC0～t、CL／F高于其他2 種提取液中（P＜0.01），其原因是雖然半仿生-酶提取液中tmax與半仿生提取液中相近，但甘草苷含量在前者中更高［16］，從而Cmax、AUC0～t也較高。

3.3.2 黃芩苷 3 種提取液中tmax均為0.083 h，而且圖1B 中血藥濃度-時間曲線呈雙峰，提示肝腸循環(huán)在黃芩苷代謝中起到重要作用［20］；半仿生-酶提取液中Cmax高于半仿生提取液中，與醇提液中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；半仿生-酶提取液中AUC0～t較高，但與半仿生提取液、醇提液中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；半仿生-酶提取液中CL／F與醇提液中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而與半仿生提取液中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明該成分吸收以半仿生-酶法提取時較好，半仿生法提取時次之。黃芩素在進入小腸上皮細胞后可迅速轉(zhuǎn)化為黃芩苷，隨后有一部分通過MRP3 蛋白轉(zhuǎn)運入血，并從腸系膜靜脈進入肝臟進一步代謝［21］，而另一部分被MRP2 蛋白泵送回腸道［22］。本實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在血液中的動態(tài)變化是由其原型成分經(jīng)水解、還原后被吸收，以及藥液中本身存在的一定量黃芩素直接吸收，經(jīng)過還原過程后共同入血產(chǎn)生。

表2 各成分主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝6）

表2 各成分主要藥動學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝6）

注：與半仿生-酶法比較，?P＜0.05，??P＜0. 01；與醇提法比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.3.3 巴馬汀 半仿生-酶提取液中tmax低于其他2 種提取液中，而且圖1C 中血藥濃度-時間曲線呈雙峰，提示巴馬汀在吸收過程中也存在肝腸循環(huán)模式；半仿生-酶提取液中Cmax、AUC0～t高于醇提液中（P＜0.01），但與半仿生提取液比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3 種提取液中CL／F比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。綜上所述，巴馬汀吸收以半仿生-酶法提取時較好，其次是半仿生法提取時。

3.3.4 小檗堿 半仿生-酶提取液中tmax短于其他2 種提取液中，而且圖1D 中血藥濃度-時間曲線呈雙峰，表明小檗堿在吸收過程中也受到肝腸循環(huán)的影響；半仿生-酶提取液中Cmax、AUC0～t高于其他2 種提取液中（P＜0.01）；3 種提取液中CL／F比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。綜上所述，小檗堿吸收以半仿生-酶法提取時較高，其次是半仿生法提取時。

3.3.5 甘草次酸 半仿生-酶提取液、半仿生提取液中tmax短于醇提液中，僅為8 h，而文獻［23-24］報道，甘草次酸t(yī)max一般在10～12 h 之間，推測上述情況可能是由于采樣點較少而導(dǎo)致其差異較大；半仿生-酶提取液中Cmax、AUC0～t高于其他2 種提取液中（P＜0.01），表明甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸后的吸收以半仿生-酶法提取時較高，其次是半仿生法提取時。另外，大鼠灌胃給予甘草酸后血液中幾乎檢測不到該成分，這是因為它在小腸中腸道菌群的作用下轉(zhuǎn)化成苷元甘草次酸后再吸收入血，從而發(fā)揮治療作用。

4 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，不同提取方法對二黃湯中5 種成分在大鼠體內(nèi)吸收速度（tmax）、吸收程度（Cmax、AUC0～t）、代謝消除率（CL／F）均有不同程度的影響，其中甘草苷吸收效果以半仿生法提取液較好，其Cmax、AUC0～t最高；黃芩苷、巴馬汀、小檗堿和甘草次酸吸收效果均以灌胃給藥半仿生-酶提取液為佳。另外，甘草苷、小檗堿、巴馬汀、甘草酸體內(nèi)生物利用度的差異與其在提取液中的含量呈正相關(guān)性，表明有效成分含量是影響其藥動學(xué)的關(guān)鍵因素。

在5.0～40 g／L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，甘草苷吸收方式均為被動轉(zhuǎn)運；黃芩苷、巴馬汀、小檗堿、甘草酸在低質(zhì)量濃度時以被動轉(zhuǎn)運為主，而在高質(zhì)量濃度時受到自身抑制作用而出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。在3 種提取方法所得提取液中，各成分吸收速率常數(shù)（Ka）、有效滲透率（Peff）、累積吸收量均有所不同，而且其腸吸收動力學(xué)與體內(nèi)藥動學(xué)保持一致。

本實驗選擇了橙皮苷、荷葉堿、熊果酸作為內(nèi)標(biāo)，分別測定黃酮（黃芩苷、甘草苷）、生物堿（巴馬汀、小檗堿）、皂苷（甘草次酸）血藥濃度，由于待測成分與內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)類似，使得后者校正結(jié)果更精確。在優(yōu)化質(zhì)譜條件時發(fā)現(xiàn)，甲酸中加入少量醋酸銨可顯著改善各成分色譜峰形，并提高甘草苷、甘草次酸離子化效率，故以乙腈-0.1% 甲酸（含10 mmol／L 乙酸銨）為流動相進行梯度洗脫，可降低檢測限，提高含量測定準(zhǔn)確度。