劉妙華，周步高，欒思宇，劉馥春，劉端勇，趙海梅

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)科研處，江西南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西南昌 330004；4.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004）

片仔癀為我國傳統(tǒng)名貴中成藥之一，主要由牛黃、天然麝香、三七、蛇膽等名貴藥材煉制而成，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，片仔癀有著抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抑制肝再生、解熱抗炎、腦保護(hù)、促進(jìn)乙醇代謝等作用，臨床上肝癌、結(jié)腸癌、食道癌、肝炎等疾病均可用其來治療［2］。

近年來，調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖的途徑在各種癌癥發(fā)病及其治療中的作用是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡［3］是機(jī)體為穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境所進(jìn)行的主動(dòng)消亡過程，可通過細(xì)胞線粒體、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、死亡受體等通路介導(dǎo)的機(jī)制發(fā)生凋亡，其中前兩者屬于內(nèi)源性凋亡通路，而后者屬于外源性凋亡通路。它有助于維持機(jī)體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡，保證器官組織生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)、新陳代謝、非正常細(xì)胞清除的正常運(yùn)營，對生理性胚胎發(fā)育、免疫細(xì)胞分化、自身免疫系統(tǒng)維持、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)損傷等具有重要意義［4］；細(xì)胞增殖也是生物體中的重要生命特征之一，主要以細(xì)胞分裂的方式源源不斷地產(chǎn)生新細(xì)胞，以替換體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞；并且其與增殖之間的相互作用是生物體內(nèi)細(xì)胞正常新陳代謝、維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的重要機(jī)制［5］，當(dāng)這種動(dòng)態(tài)平衡被打破、調(diào)控基因異常表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡被抑制，細(xì)胞無限增殖分化，從而產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞，故誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制腫瘤細(xì)胞增殖是相關(guān)治療的重要途徑［6］。本文就片仔癀調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖的途徑作一綜述，以期為該方的保護(hù)和進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 片仔癀對腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖的調(diào)控效果

1.1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是一種自主的有序性死亡，由基因控制為穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境而進(jìn)行的生物學(xué)現(xiàn)象。陳炳藝［7］觀察Hoechst 33342 染色后的MG63／ADM 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，片仔癀干預(yù)后細(xì)胞核相繼呈現(xiàn)胞核聚縮、月牙狀改變、典型凋亡小體的現(xiàn)象，提示該方可使MG63／ADM 細(xì)胞凋亡加速。在片仔癀調(diào)控人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)［8］中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示對照組中OVCAR-3 細(xì)胞早期凋亡率為0，而經(jīng)過250、500、1 000 μg／mL 片仔癀處理24 h后，其凋亡率分別6.6%、30.9%、43.2%，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，也提示了該方可促進(jìn)OVCAR-3 細(xì)胞凋亡。

1.2 抑制腫瘤細(xì)胞增殖 細(xì)胞增殖是機(jī)體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳過程中不可或缺的一部分。在片仔癀對大腸癌細(xì)胞HT-29、HCT-8／5-FU 和HCT-8 細(xì)胞生長的研究中，MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方能明顯地抑制HT-29、HCT-8／5-FU、HCT-8 細(xì)胞增殖，并具有明顯的劑量依賴性［9-10］；HCT-8／5-FU 細(xì)胞數(shù)明顯減少，體積也有不同程度的縮小，甚至發(fā)生懸浮、脫落而死亡的現(xiàn)象，均與藥物劑量呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了該方對人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。

2 片仔癀調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖的途徑

2.1 激活線粒體凋亡途徑 線粒體在作為細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化核心的同時(shí)，更是扮演著脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡中樞調(diào)控者的角色。在線粒體膜內(nèi)外Bcl-2 家族成員的相互介導(dǎo)下，可導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生變化，跨膜電位下降，細(xì)胞色素C 和其他蛋白從線粒體膜內(nèi)向外釋放，最終激活線粒體凋亡途徑［11］。張燕等［12］在片仔癀影響骨肉瘤U2OS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞線粒體膜電位可被不同劑量片仔癀降低，并與其劑量呈正相關(guān)，降低率分別為10.07%、19.57%、24.90%，并隨著其劑量升高凋亡率明顯上升，表明該方可呈劑量依賴性地下調(diào)線粒體膜電位，從而介導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡。

2.2 抑制STAT3 途徑 STAT3 信號(hào)被激活后，可轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA 的反應(yīng)原件聯(lián)合，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡等一系列生理過程［13］，但其持續(xù)性激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速惡性轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展，而且Bcl-2、Bcl-xl 等抗凋亡基因的表達(dá)會(huì)隨著STAT3 信號(hào)的激活被促進(jìn)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明，片仔癀可呈劑量依賴性地降低p-STAT3、Bcl-2 表達(dá)，從而達(dá)到抑制舌鱗癌Tca8113 細(xì)胞增殖的作用［14］，可能是通過抑制STAT3 通路來實(shí)現(xiàn)。

2.3 抑制PI3K／Akt 通路 PI3K／Akt 信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生長增殖、阻礙細(xì)胞凋亡的過程中承擔(dān)著重要作用，并且在多種腫瘤中異常表達(dá)［15］。Akt 作為PI3K 信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，其磷酸化水平提高可導(dǎo)致其下游蛋白分子（如Bad、caspase-9、NF-κB、mTOR 等）發(fā)生一系列變化，引起細(xì)胞增殖、分化、凋亡效應(yīng)［16］，同時(shí)抑癌基因類脂磷酸酶PTEN 可使Akt 的磷酸化被阻斷，使PI3K／Akt 信號(hào)通路失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。陳炳藝等［18］報(bào)道，片仔癀處理48 h 后可明顯上調(diào)PTEN 在人骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG63／ADM中的表達(dá)，并下調(diào)p-Akt 表達(dá)，表明該方可通過影響PTEN、p-Akt 表達(dá)來調(diào)控PI3K／AKT 信號(hào)通路，從而達(dá)到抑制MG63／ADM 細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的效果；林海英等［19］也證實(shí)了片仔癀干預(yù)后可使PI3K、p85α、Akt 蛋白磷酸化被抑制，導(dǎo)致PI3K／Akt 信號(hào)失活，最終誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡。

2.4 抑制Notch 通路 Notch 信號(hào)通路屬于跨膜受體信號(hào)通路家族，具有高度保守性，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡所發(fā)揮的關(guān)鍵調(diào)控作用主要是通過介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用實(shí)現(xiàn)的，它主要由Notch 受體、配體、調(diào)節(jié)因子、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等組成［20］，其配體與受體相結(jié)合后被激活，可引起Notch 蛋白裂解，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子RPB-Jκ 結(jié)合形成復(fù)合物，從而激活其下游靶基因Hes、Hey、Herp 等轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，最終引起細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程［21］。研究表明，片仔癀能顯著抑制大腸癌干細(xì)胞中Notch1 和Hes1 的表達(dá)，并隨其劑量增加而細(xì)胞增殖率下降，提示該方可能是通過調(diào)控Notch 通路來抑制大腸癌干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)大腸癌干細(xì)胞的凋亡及分化［22］。

2.5 抑制Wnt／β-catenin 通路 Wnt／β-catenin 通路是一條高度保守的信號(hào)通路，與細(xì)胞增殖分化和機(jī)體平衡密切相關(guān)［23］，亦是調(diào)控大腸癌干細(xì)胞生長的主要通路之一［24］，大腸癌干細(xì)胞增殖及致瘤都與其相關(guān)。其中，β-catenin 是該通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)Lgr-5 是大

腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記蛋白，也是維持其致瘤性的關(guān)鍵因子［25］。魏麗慧［26］報(bào)道，片仔癀干預(yù)后的大腸癌干細(xì)胞密度減少，活力及成瘤能力均下降，與對照組相比β-catenin、Lgr-5 的mRNA 及蛋白表達(dá)明顯降低，表明該方可通過抑制Wnt／β-catenin 通路來達(dá)到抑制大腸癌干細(xì)胞增殖的效果。

3 片仔癀調(diào)控細(xì)胞凋亡與增殖的相關(guān)基因與蛋白

3.1 Caspase 家族 Caspase 家族是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白酶之一，被相關(guān)信號(hào)通路激活后能使Caspase 隨之進(jìn)入級聯(lián)反應(yīng)，降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞凋亡行為。研究表明，隨著片仔癀劑量的逐漸增加，骨肉瘤MG63 細(xì)胞中caspase-3、caspase-9 表達(dá)均明顯提升，提示該方能通過調(diào)控caspase-3、caspase-9 表達(dá)來誘導(dǎo)骨肉瘤MG63 細(xì)胞凋亡［27］。Lin 等［28］也證實(shí)了片仔癀能呈劑量依賴性地激活caspase-3 的表達(dá)，刺激細(xì)胞凋亡的分子級聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞株死亡。

3.2 Bcl-2 家族 Bcl-2 家族能調(diào)控線粒體中細(xì)胞色素C 等凋亡基因的釋放，是線粒體參與的凋亡途徑中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，可通過多種途徑來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如線粒體、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、氧化自由基（ROS）、Bcl-2／Bax 等。實(shí)驗(yàn)表明，骨肉瘤MG63 細(xì)胞經(jīng)片仔癀處理后，Bcl-2 蛋白表達(dá)呈明顯的下降趨勢，而Bax 表達(dá)明顯升高，并且隨著其劑量增加Bax／Bcl-2 也逐漸上升［27］，提示該方可通過調(diào)控Bcl-2、Bax 表達(dá)來促進(jìn)MG63 細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.3 p53 蛋白家族 p53 蛋白家族在預(yù)防癌癥方面起著重要作用，能在細(xì)胞有絲分裂G 期監(jiān)視DNA 完整性，是一種抑癌基因，若監(jiān)測到有損傷，則促使細(xì)胞自我修復(fù)；但若損傷過大，則不能完全復(fù)原DNA，p53 會(huì)誘導(dǎo)其凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)大腸癌患者組織和細(xì)胞中PNO1 基因的表達(dá)往往會(huì)有顯著性的升高，且實(shí)驗(yàn)表明通過片仔癀處理可使PNO1沉默并激活P53 通路，導(dǎo)致P53 及其下游P21 表達(dá)明顯上調(diào)［29］，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

3.4 Ki-67、HGF mRNA Ki-67 是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，它除了在細(xì)胞靜止期G0期不表達(dá)外，在細(xì)胞分裂的G1、S、G2、M 期中均有表達(dá)［30-31］。在片仔癀預(yù)處理后的70%肝切除小鼠中發(fā)現(xiàn)，肝組織中Ki-67、肝細(xì)胞生長因子（HGF）mRNA 表達(dá)明顯下降，表明該方能抑制殘余肝組織細(xì)胞的增殖［32］；莊群川等［9］在片仔癀干預(yù)后的移植瘤組織中發(fā)現(xiàn)，Ki-67 蛋白表達(dá)明顯下降，表明該方可通過下調(diào)Ki-67蛋白水平來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

4 展望

片仔癀可通過激活線粒體凋亡途徑、抑制STAT3 通路、PI3K／Akt 通路、Notch 通路、Wnt／β-catenin 通路等多種途徑及相關(guān)靶基因與蛋白來影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等過程，而這些信號(hào)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡引起的功能與狀態(tài)紊亂在自身免疫性疾病、癌癥等發(fā)生過程發(fā)揮了重要角色，可為該方治療包括腫瘤在內(nèi)的其他疾病、拓展其臨床主治范圍提供了參考依據(jù)。另外，這幾條通路存在多個(gè)關(guān)聯(lián)點(diǎn)［33-38］，并最終都能起到調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的作用（圖1），但它們之間具體是如何關(guān)聯(lián)起來發(fā)揮調(diào)控作用尚不明確，這也是今后課題組研究方向。

圖1 片仔癀調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)圖

目前，關(guān)于片仔癀調(diào)控細(xì)胞凋亡與增殖方面的研究尚停留在以腫瘤為主的信號(hào)通路干預(yù)方面，而對該方調(diào)控的明確靶點(diǎn)和相關(guān)基因、腫瘤和炎癥微環(huán)境、與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的細(xì)胞自噬和焦亡、調(diào)控細(xì)胞凋亡與增殖的有效組分和部位等方面的研究還不夠深入，也不夠明確，而且是否具有更加適宜的劑型也是目前困擾相關(guān)新藥研發(fā)的關(guān)鍵性問題。因此，加快片仔癀在其他疾病細(xì)胞凋亡與增殖方面中的藥理學(xué)研究、有效組分和部位的篩選挖掘、劑型改造等對保護(hù)和開發(fā)該方具有深遠(yuǎn)而現(xiàn)實(shí)的意義。