申美倫,梁業(yè)飛,劉廣欣,桑 杰,李翠芹
(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710062)
甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草G.GlabraL.或脹果甘草G.inflataBat.的干燥根及根莖,具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效[1]?,F(xiàn)代藥理研究表明,甘草黃酮具有抗炎、抗氧化[2]、抗病毒[3]等作用,目前已分離出300 多種[4],主要活性成分有甘草苷、甘草素、異甘草素、光甘草定、甘草查爾酮A 等,其中光甘草定、甘草查爾酮A 分別為光果甘草脹果甘草中特有成分,廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域[5-6],故生產(chǎn)高品質(zhì)的該類化合物已成為生產(chǎn)企業(yè)急需解決的問(wèn)題之一。
本文概述了甘草黃酮提取分離的方法,并針對(duì)上述操作過(guò)程中存在的資源浪費(fèi)、耗能高、效率低、以單一類成分提取分離為目標(biāo)等問(wèn)題提出解決方法,以期為該類成分的相關(guān)后續(xù)研究提供參考。
1.1 提取方法
1.1.1 溶劑提取法 溶劑提取法利用“相似相溶”原理對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取,雖然存在提取時(shí)間長(zhǎng)(90~210 min)、提取溫度高(40~90 ℃)、溶劑用量大等缺點(diǎn),但因其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便,目前仍作為工業(yè)化生產(chǎn)甘草黃酮類化合物的主要方法。表1 顯示,提取過(guò)甘草酸的甘草渣中總黃酮得率較高[7-8],故可將其作為提取總黃酮的原料,避免資源浪費(fèi)。另外,不同品種甘草中總黃酮含量有所不同[9],故研究時(shí)應(yīng)其甘草品種。
表1 溶劑提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)()
表1 溶劑提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)()
注:a 為提取率,b 為含量,c 為得率。
1.1.2 超聲輔助提取法 超聲輔助提取法根據(jù)空化作用在溶劑中局部形成高溫高壓,使樣品內(nèi)部疏松,增強(qiáng)溶劑穿透能力,提高有效成分提取率[12],大多用乙醇作為提取溶劑。表2 顯示,與傳統(tǒng)溶劑提取法(40~90 ℃,90~210 min)相比,超聲輔助提取法的溫度較低(45~65 ℃),時(shí)間較短(25~120 min)。
1.1.3 微波輔助提取 微波輔助提取法通過(guò)微波使藥材細(xì)胞承受高溫高壓瞬間破裂,細(xì)胞內(nèi)有效成分溶于溶劑,從而提高目標(biāo)成分提取率。表3 顯示,與溶劑提取法(90~210 min)、超聲提取法(25~120 min)相比,微波提取法(2.4~6 min)能大大縮短提取時(shí)間;β-環(huán)糊精作為提取溶劑時(shí),可提高目標(biāo)成分的水溶性與穩(wěn)定性[16-17],有利于提取甘草總黃酮。另外,微波提取法與其他方法聯(lián)用也可用于甘草總黃酮的提取[18]。
表2 超聲輔助提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)
表3 微波輔助提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)
1.1.4 其他方法 除上述提取方法外,還有雙水相提取法、閃式提取法、超臨界CO2萃取法、微生物混合發(fā)酵提取法等。其中,雙水相提取法將不相混溶的兩相親水性提取體系作為溶劑,具有環(huán)保、低成本、集提取與分離為一體等優(yōu)點(diǎn)[22],與超聲提取法結(jié)合后可提高兩相提取體系的擴(kuò)散速度和目標(biāo)成分得率[23];閃式提取法利用高速機(jī)械剪切力迅速將藥材組織破碎,使溶劑更易進(jìn)入藥材內(nèi)部提取目標(biāo)成分,具有提取時(shí)間短、便于熱敏性成分提取等優(yōu)點(diǎn),與常規(guī)溶劑提取法(60~210 min)相比其提取時(shí)間大大縮短(3 min),而目標(biāo)成分得率無(wú)明顯變化;超臨界CO2萃取法選擇超臨界CO2作為提取溶劑,可使目標(biāo)成分保持原有生物活性不變,無(wú)溶劑殘留,而且提取過(guò)程綠色環(huán)保;微生物混合發(fā)酵提取法利用微生物完善植物細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)纖維素降解酶系,促使纖維素酶酶解藥材細(xì)胞壁[24],提高目標(biāo)成分提取率,而且其原料普遍為提取過(guò)甘草酸的甘草渣,可避免了資源浪費(fèi)。具體見(jiàn)表4。
表4 其他方法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)
1.2 分離方法
1.2.1 聚酰胺柱色譜法 聚酰胺色譜利用分子中的酰胺羰基或酰胺鍵上的游離胺基與目標(biāo)成分形成氫鍵而產(chǎn)生吸附,從而達(dá)到分離純化目的。姜紅紅等[29]優(yōu)化所得甘草總黃酮最佳純化工藝條件為上樣液pH 5,體積流量1 mL/min,徑高比1∶10,上樣質(zhì)量濃度0.15 g/mL,純度為90.12%。
1.2.2 大孔吸附樹脂法 大孔吸附樹脂利用范德華引力,根據(jù)吸附力和分子篩原理來(lái)達(dá)到分離、純化、除雜等目的。表5 顯示,用于分離純化甘草總黃酮的大孔吸附樹脂大多為非極性或中極性,其次上樣液、洗脫液pH 由于會(huì)影響溶質(zhì)電離程度而影響黃酮吸附率、解吸率[30-31],故應(yīng)對(duì)pH進(jìn)行考察。
表5 大孔吸附樹脂法分離甘草總黃酮的工藝參數(shù)
1.2.3 連續(xù)離子交換色譜法 連續(xù)離子交換色譜在離子交換色譜的基礎(chǔ)上加以改進(jìn),將一個(gè)具有多個(gè)色譜柱的圓盤與多孔分配閥組合,利用分配閥的相對(duì)轉(zhuǎn)換,使吸附、水洗、解析、再生等步驟在一個(gè)工藝流程系統(tǒng)中完成,具有溶劑用量小、分離時(shí)間短、回收率較高等優(yōu)點(diǎn)。李清潭等[36]利用連續(xù)離子交換色譜法得到最佳分離工藝為上樣液質(zhì)量濃度1.0 mg/mL,體積2.70 L,體積流量12.5 mL/min,乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)70%,體積1.80 L,體積流量12.50 mL/min;NaOH 洗脫濃度 0.50 mol/L,體積0.6 L,體積流量5.0 mL/min,甘草黃酮純度為67.33%,得率2.68%。
1.2.4 反向二維色譜法 反向二維色譜法將不同分離機(jī)理的分離模式進(jìn)行組合,以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜化學(xué)成分的分離和制備,具有高峰容量、高通量、高效率等優(yōu)點(diǎn)。朱靖博等[37]利用反向二維色譜法構(gòu)建甘草黃酮的系統(tǒng)分離手段,即以C18為分離及富集填料,甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相,水為富集稀釋液,梯度洗脫、稀釋富集液體積流量21 mL/min,上樣量300 mg,富集次數(shù)3 次,可得到16 個(gè)甘草黃酮部位和甘草苷、甘草素等9 個(gè)化合物。
甘草苷是甘草重要活性成分,屬于二氫黃酮苷類化合物,具有抗抑郁[38]、心肌細(xì)胞保護(hù)作用[39]等藥理活性,2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定甘草及其浸膏中甘草苷含量應(yīng)不低于0.5%[1]。甘草素屬于二氫黃酮類化合物,是甘草苷苷元部分,具有抗炎[40-41]、保肝解毒[42-43]等作用。
2.1 提取方法
2.1.1 溶劑提取法 朱應(yīng)懷等[44]利用氨水提取甘草苷,得到最佳提取條件為24 倍0.75% 氨水提取3 次,每次60 min,甘草苷平均提取率為72.3%;王振輝等[45]用正交試驗(yàn)優(yōu)化加熱回流提取甘草苷的最佳回流提取條件為10 倍量70%乙醇提取2 次,每次3 h,甘草苷得率為1.62%。
2.1.2 超聲輔助提取法 叢景香[46]等得到超聲輔助提取甘草苷的最佳條件為酸濃度0.5 mol/L,提取時(shí)間1.5 h,提取溫度70 ℃,料液比1∶20,甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.850%。另外,與溶劑提取法(3~6 h)相比,超聲輔助提取法(0.4~1.5 h)能縮短提取時(shí)間,減少溶劑用量。
2.1.3 酶水解法 任玲等[47]利用酶水解法得到甘草素最優(yōu)提取工藝為纖維素酶添加量1.85%,酶解溫度65 ℃,酶解時(shí)間131 min,甘草素轉(zhuǎn)化率為98.6%。
2.2 分離方法 田彥芳等[48]用ADS-7 型大孔吸附樹脂同時(shí)分離純化包括甘草苷在內(nèi)的6 種黃酮,避免了僅以甘草苷作為指標(biāo)時(shí)造成的資源浪費(fèi)。除常用的分離方法外[48-49],還有多種新手段[50-55]的應(yīng)用,其中超濾法[52]、固相萃取法[53-54]等在提取純化甘草苷時(shí)能解決設(shè)備難以用于工業(yè)化、工藝繁瑣等問(wèn)題,適合大生產(chǎn);絡(luò)合萃取法通過(guò)被萃取物和萃取溶劑之間的化學(xué)反應(yīng),生成可溶于萃取溶劑的新萃合物,從而實(shí)現(xiàn)分離目的[55],以其分離純化甘草苷時(shí)不僅能減少溶劑用量,提高回收率,還具有簡(jiǎn)化分離工藝、無(wú)設(shè)備要求等優(yōu)點(diǎn),便于工業(yè)化推廣。具體見(jiàn)表6。
表6 分離甘草苷、甘草素的工藝參數(shù)
光甘草定屬于異黃酮類成分,是光果甘草中特有的黃酮類化合物,具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性[56]。
3.1 提取方法
3.1.1 溶劑提取法 范玉涵等[57]報(bào)道,光甘草定最佳提取工藝為乙醇回流提取2 次,每次2 h,料液比1∶10,得率為0.156 6%。
3.1.2 超臨界CO2萃取法 王宏鵬等[58]利用超臨界CO2萃取光甘草定,發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件為萃取溫度45 ℃,萃取壓力25 MPa,靜態(tài)萃取時(shí)間60 min,得率為1.259%。
3.1.3 微波輔助提取法 李雪琴等[59]采用微波提取法提取光甘草定,發(fā)現(xiàn)最佳工藝為提取溶劑70%乙醇,料液比1∶15,提取溫度65 ℃,提取時(shí)間40 min,粗提得率為1.259%,得率為0.009%。
3.2 分離方法 除常用分離方法外[57,60],為解決工藝的工業(yè)化適用性問(wèn)題,固相萃取法[61]、疏水性離子液體萃取法[62]、分子印跡法[63]等新技術(shù)因其顯著減少溶劑用量、可重復(fù)使用、簡(jiǎn)化分離工藝、提高光甘草定回收率的優(yōu)點(diǎn)而逐漸被開發(fā)應(yīng)用。具體見(jiàn)表7。
表7 分離光甘草定的工藝參數(shù)
甘草查爾酮A 為查爾酮類成分,是脹果甘草中特有的黃酮類化合物,具有抑制酪氨酸酶活性[64]、抗菌消炎[65]等作用。目前,并無(wú)直接提取甘草查爾酮A 的方法,一般是先提取甘草總黃酮,再分離得到該成分,通常是幾種方法聯(lián)合應(yīng)用。
Luo 等[35]將甘草粗提物經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺層析后,甘草查爾酮A 純度可達(dá)80.28%;韓龍哲等[66]將甘草總黃酮先經(jīng)硅膠柱色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(9∶1)為洗脫劑梯度洗脫,再經(jīng)聚酰胺柱色譜分離,以甲醇-水(6∶4)為洗脫劑梯度洗脫,洗脫部分經(jīng)重結(jié)晶后得甘草查爾酮A;鞠偉會(huì)等[67]將甘草總黃酮經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺層析柱純化后,再用乙醇重結(jié)晶,甘草查爾酮A 純度可達(dá)95%以上。
目前,對(duì)甘草黃酮的提取已逐漸向低能耗、綠色環(huán)保、高提取率的方向發(fā)展,如超聲輔助提取法[13-14,46]、雙水相提取法[23]、超臨界CO2萃取法[26,58]等,但如何將其規(guī)模從實(shí)驗(yàn)室小試擴(kuò)大至中試車間,最終應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)仍需進(jìn)行研究。同時(shí),在上述操作過(guò)程中仍以甘草酸、甘草次酸等皂苷類成分開發(fā)利用為主,藥渣中的黃酮有待進(jìn)一步開發(fā)利用。另外,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,如何根據(jù)甘草中皂苷、黃酮、多糖本身的特點(diǎn)來(lái)研發(fā)節(jié)能環(huán)保高效的同時(shí)提取分離技術(shù)也應(yīng)作為以后考察方向之一。
目前,甘草黃酮主要分離方法為大孔吸附樹脂法[60,66,68-69]、聚酰胺柱色譜法[29,49]等,但目前大多以單一成分為目標(biāo),如何分離所有成分是今后研究的重點(diǎn),同時(shí)尋找到適合其工業(yè)化的分離方法也是未來(lái)目標(biāo)之一。近年來(lái),模擬移動(dòng)床色譜法[50]、離子液萃取法[51]、膜分離法[52]等新方法層出不窮,可不斷探索它們?cè)诟什蔹S酮分離中的應(yīng)用,尋找到更環(huán)保高效、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的手段。