申美倫，梁業(yè)飛，劉廣欣，桑 杰，李翠芹

（陜西師范大學生命科學學院，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西西安 710062）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草G.GlabraL.或脹果甘草G.inflataBat.的干燥根及根莖，具有補脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，甘草黃酮具有抗炎、抗氧化［2］、抗病毒［3］等作用，目前已分離出300 多種［4］，主要活性成分有甘草苷、甘草素、異甘草素、光甘草定、甘草查爾酮A 等，其中光甘草定、甘草查爾酮A 分別為光果甘草脹果甘草中特有成分，廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域［5-6］，故生產(chǎn)高品質(zhì)的該類化合物已成為生產(chǎn)企業(yè)急需解決的問題之一。

本文概述了甘草黃酮提取分離的方法，并針對上述操作過程中存在的資源浪費、耗能高、效率低、以單一類成分提取分離為目標等問題提出解決方法，以期為該類成分的相關(guān)后續(xù)研究提供參考。

1 甘草總黃酮

1.1 提取方法

1.1.1 溶劑提取法 溶劑提取法利用“相似相溶”原理對目標化合物進行提取，雖然存在提取時間長（90～210 min）、提取溫度高（40～90 ℃）、溶劑用量大等缺點，但因其設(shè)備簡單、操作簡便，目前仍作為工業(yè)化生產(chǎn)甘草黃酮類化合物的主要方法。表1 顯示，提取過甘草酸的甘草渣中總黃酮得率較高［7-8］，故可將其作為提取總黃酮的原料，避免資源浪費。另外，不同品種甘草中總黃酮含量有所不同［9］，故研究時應(yīng)其甘草品種。

表1 溶劑提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)（）

表1 溶劑提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)（）

注：a 為提取率，b 為含量，c 為得率。

1.1.2 超聲輔助提取法 超聲輔助提取法根據(jù)空化作用在溶劑中局部形成高溫高壓，使樣品內(nèi)部疏松，增強溶劑穿透能力，提高有效成分提取率［12］，大多用乙醇作為提取溶劑。表2 顯示，與傳統(tǒng)溶劑提取法（40～90 ℃，90～210 min）相比，超聲輔助提取法的溫度較低（45～65 ℃），時間較短（25～120 min）。

1.1.3 微波輔助提取 微波輔助提取法通過微波使藥材細胞承受高溫高壓瞬間破裂，細胞內(nèi)有效成分溶于溶劑，從而提高目標成分提取率。表3 顯示，與溶劑提取法（90～210 min）、超聲提取法（25～120 min）相比，微波提取法（2.4～6 min）能大大縮短提取時間；β-環(huán)糊精作為提取溶劑時，可提高目標成分的水溶性與穩(wěn)定性［16-17］，有利于提取甘草總黃酮。另外，微波提取法與其他方法聯(lián)用也可用于甘草總黃酮的提?。?8］。

表2 超聲輔助提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)

表3 微波輔助提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)

1.1.4 其他方法 除上述提取方法外，還有雙水相提取法、閃式提取法、超臨界CO2萃取法、微生物混合發(fā)酵提取法等。其中，雙水相提取法將不相混溶的兩相親水性提取體系作為溶劑，具有環(huán)保、低成本、集提取與分離為一體等優(yōu)點［22］，與超聲提取法結(jié)合后可提高兩相提取體系的擴散速度和目標成分得率［23］；閃式提取法利用高速機械剪切力迅速將藥材組織破碎，使溶劑更易進入藥材內(nèi)部提取目標成分，具有提取時間短、便于熱敏性成分提取等優(yōu)點，與常規(guī)溶劑提取法（60～210 min）相比其提取時間大大縮短（3 min），而目標成分得率無明顯變化；超臨界CO2萃取法選擇超臨界CO2作為提取溶劑，可使目標成分保持原有生物活性不變，無溶劑殘留，而且提取過程綠色環(huán)保；微生物混合發(fā)酵提取法利用微生物完善植物細胞內(nèi)木質(zhì)纖維素降解酶系，促使纖維素酶酶解藥材細胞壁［24］，提高目標成分提取率，而且其原料普遍為提取過甘草酸的甘草渣，可避免了資源浪費。具體見表4。

表4 其他方法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)

1.2 分離方法

1.2.1 聚酰胺柱色譜法 聚酰胺色譜利用分子中的酰胺羰基或酰胺鍵上的游離胺基與目標成分形成氫鍵而產(chǎn)生吸附，從而達到分離純化目的。姜紅紅等［29］優(yōu)化所得甘草總黃酮最佳純化工藝條件為上樣液pH 5，體積流量1 mL／min，徑高比1∶10，上樣質(zhì)量濃度0.15 g／mL，純度為90.12%。

1.2.2 大孔吸附樹脂法 大孔吸附樹脂利用范德華引力，根據(jù)吸附力和分子篩原理來達到分離、純化、除雜等目的。表5 顯示，用于分離純化甘草總黃酮的大孔吸附樹脂大多為非極性或中極性，其次上樣液、洗脫液pH 由于會影響溶質(zhì)電離程度而影響黃酮吸附率、解吸率［30-31］，故應(yīng)對pH進行考察。

表5 大孔吸附樹脂法分離甘草總黃酮的工藝參數(shù)

1.2.3 連續(xù)離子交換色譜法 連續(xù)離子交換色譜在離子交換色譜的基礎(chǔ)上加以改進，將一個具有多個色譜柱的圓盤與多孔分配閥組合，利用分配閥的相對轉(zhuǎn)換，使吸附、水洗、解析、再生等步驟在一個工藝流程系統(tǒng)中完成，具有溶劑用量小、分離時間短、回收率較高等優(yōu)點。李清潭等［36］利用連續(xù)離子交換色譜法得到最佳分離工藝為上樣液質(zhì)量濃度1.0 mg／mL，體積2.70 L，體積流量12.5 mL／min，乙醇洗脫體積分數(shù)70%，體積1.80 L，體積流量12.50 mL／min；NaOH 洗脫濃度 0.50 mol／L，體積0.6 L，體積流量5.0 mL／min，甘草黃酮純度為67.33%，得率2.68%。

1.2.4 反向二維色譜法 反向二維色譜法將不同分離機理的分離模式進行組合，以實現(xiàn)對復(fù)雜化學成分的分離和制備，具有高峰容量、高通量、高效率等優(yōu)點。朱靖博等［37］利用反向二維色譜法構(gòu)建甘草黃酮的系統(tǒng)分離手段，即以C18為分離及富集填料，甲醇-水、乙腈-水為流動相，水為富集稀釋液，梯度洗脫、稀釋富集液體積流量21 mL／min，上樣量300 mg，富集次數(shù)3 次，可得到16 個甘草黃酮部位和甘草苷、甘草素等9 個化合物。

2 甘草苷、甘草素

甘草苷是甘草重要活性成分，屬于二氫黃酮苷類化合物，具有抗抑郁［38］、心肌細胞保護作用［39］等藥理活性，2015 年版《中國藥典》 規(guī)定甘草及其浸膏中甘草苷含量應(yīng)不低于0.5%［1］。甘草素屬于二氫黃酮類化合物，是甘草苷苷元部分，具有抗炎［40-41］、保肝解毒［42-43］等作用。

2.1 提取方法

2.1.1 溶劑提取法 朱應(yīng)懷等［44］利用氨水提取甘草苷，得到最佳提取條件為24 倍0.75% 氨水提取3 次，每次60 min，甘草苷平均提取率為72.3%；王振輝等［45］用正交試驗優(yōu)化加熱回流提取甘草苷的最佳回流提取條件為10 倍量70%乙醇提取2 次，每次3 h，甘草苷得率為1.62%。

2.1.2 超聲輔助提取法 叢景香［46］等得到超聲輔助提取甘草苷的最佳條件為酸濃度0.5 mol／L，提取時間1.5 h，提取溫度70 ℃，料液比1∶20，甘草苷質(zhì)量分數(shù)6.850%。另外，與溶劑提取法（3～6 h）相比，超聲輔助提取法（0.4～1.5 h）能縮短提取時間，減少溶劑用量。

2.1.3 酶水解法 任玲等［47］利用酶水解法得到甘草素最優(yōu)提取工藝為纖維素酶添加量1.85%，酶解溫度65 ℃，酶解時間131 min，甘草素轉(zhuǎn)化率為98.6%。

2.2 分離方法 田彥芳等［48］用ADS-7 型大孔吸附樹脂同時分離純化包括甘草苷在內(nèi)的6 種黃酮，避免了僅以甘草苷作為指標時造成的資源浪費。除常用的分離方法外［48-49］，還有多種新手段［50-55］的應(yīng)用，其中超濾法［52］、固相萃取法［53-54］等在提取純化甘草苷時能解決設(shè)備難以用于工業(yè)化、工藝繁瑣等問題，適合大生產(chǎn)；絡(luò)合萃取法通過被萃取物和萃取溶劑之間的化學反應(yīng)，生成可溶于萃取溶劑的新萃合物，從而實現(xiàn)分離目的［55］，以其分離純化甘草苷時不僅能減少溶劑用量，提高回收率，還具有簡化分離工藝、無設(shè)備要求等優(yōu)點，便于工業(yè)化推廣。具體見表6。

表6 分離甘草苷、甘草素的工藝參數(shù)

3 光甘草定

光甘草定屬于異黃酮類成分，是光果甘草中特有的黃酮類化合物，具有較強的酪氨酸酶抑制活性［56］。

3.1 提取方法

3.1.1 溶劑提取法 范玉涵等［57］報道，光甘草定最佳提取工藝為乙醇回流提取2 次，每次2 h，料液比1∶10，得率為0.156 6%。

3.1.2 超臨界CO2萃取法 王宏鵬等［58］利用超臨界CO2萃取光甘草定，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件為萃取溫度45 ℃，萃取壓力25 MPa，靜態(tài)萃取時間60 min，得率為1.259%。

3.1.3 微波輔助提取法 李雪琴等［59］采用微波提取法提取光甘草定，發(fā)現(xiàn)最佳工藝為提取溶劑70%乙醇，料液比1∶15，提取溫度65 ℃，提取時間40 min，粗提得率為1.259%，得率為0.009%。

3.2 分離方法 除常用分離方法外［57，60］，為解決工藝的工業(yè)化適用性問題，固相萃取法［61］、疏水性離子液體萃取法［62］、分子印跡法［63］等新技術(shù)因其顯著減少溶劑用量、可重復(fù)使用、簡化分離工藝、提高光甘草定回收率的優(yōu)點而逐漸被開發(fā)應(yīng)用。具體見表7。

表7 分離光甘草定的工藝參數(shù)

4 甘草查爾酮A

甘草查爾酮A 為查爾酮類成分，是脹果甘草中特有的黃酮類化合物，具有抑制酪氨酸酶活性［64］、抗菌消炎［65］等作用。目前，并無直接提取甘草查爾酮A 的方法，一般是先提取甘草總黃酮，再分離得到該成分，通常是幾種方法聯(lián)合應(yīng)用。

Luo 等［35］將甘草粗提物經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺層析后，甘草查爾酮A 純度可達80.28%；韓龍哲等［66］將甘草總黃酮先經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（9∶1）為洗脫劑梯度洗脫，再經(jīng)聚酰胺柱色譜分離，以甲醇-水（6∶4）為洗脫劑梯度洗脫，洗脫部分經(jīng)重結(jié)晶后得甘草查爾酮A；鞠偉會等［67］將甘草總黃酮經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺層析柱純化后，再用乙醇重結(jié)晶，甘草查爾酮A 純度可達95%以上。

5 結(jié)語與展望

目前，對甘草黃酮的提取已逐漸向低能耗、綠色環(huán)保、高提取率的方向發(fā)展，如超聲輔助提取法［13-14，46］、雙水相提取法［23］、超臨界CO2萃取法［26，58］等，但如何將其規(guī)模從實驗室小試擴大至中試車間，最終應(yīng)用到實際生產(chǎn)仍需進行研究。同時，在上述操作過程中仍以甘草酸、甘草次酸等皂苷類成分開發(fā)利用為主，藥渣中的黃酮有待進一步開發(fā)利用。另外，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，如何根據(jù)甘草中皂苷、黃酮、多糖本身的特點來研發(fā)節(jié)能環(huán)保高效的同時提取分離技術(shù)也應(yīng)作為以后考察方向之一。

目前，甘草黃酮主要分離方法為大孔吸附樹脂法［60，66，68-69］、聚酰胺柱色譜法［29，49］等，但目前大多以單一成分為目標，如何分離所有成分是今后研究的重點，同時尋找到適合其工業(yè)化的分離方法也是未來目標之一。近年來，模擬移動床色譜法［50］、離子液萃取法［51］、膜分離法［52］等新方法層出不窮，可不斷探索它們在甘草黃酮分離中的應(yīng)用，尋找到更環(huán)保高效、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的手段。