劉 雯劉 云侯小濤 鐘燕妮

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221002；3.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

厚藤I(mǎi)pomoea pes-caprae（Linn.）Sweet，系旋花科番薯屬草本植物，又稱馬鞍藤、海灘牽牛、二葉紅薯等，在我國(guó)主要分布于廣西、廣東、福建、臺(tái)灣等東南沿海地區(qū)，植物資源豐富［1］。全草入藥，具有祛風(fēng)除濕、拔毒消腫的功效，主治風(fēng)寒感冒、風(fēng)濕痹痛、癰腫疔毒，外用治瘡癤、痔瘡［2］。厚藤主要含香豆素、萜類、黃酮、生物堿、奎尼酸等成分［3-8］?，F(xiàn)代研究表明，厚藤具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗膠原酶、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［9-12］。迄今為止，有關(guān)厚藤質(zhì)量控制方面的研究報(bào)道較少。馮小慧等［13-14］建立了厚藤TLC鑒別方法及HPLC 法測(cè)定6 種成分的含量。厚藤的傳統(tǒng)藥用部位是全草，關(guān)于其不同部位的比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)中草藥不同部位組分差異的研究具有重要意義［15-18］。本研究采用HPLC 法測(cè)定了厚藤不同部位（花、葉、果實(shí)、嫩莖、老莖）中8 種成分的含量，以期闡明厚藤不同部位之間的差異，為其質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用及資源的合理開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料

Waters e2695 高效液相色譜儀，包括UV 型紫外檢測(cè)器、沃特世工作站（美國(guó)Waters 公司）；PRACTUM224-1CN 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。水為純凈水；甲醇為分析純；乙腈為色譜純。對(duì)照品綠原酸（批號(hào) 110753-201817，純度96.8%）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，純度 99.7%）、異槲皮苷（111809-201804，純度97.2%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)6630）、隱綠原酸（批號(hào)3208）、異綠原酸B（批號(hào)3089）均購(gòu)自購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；異綠原酸A（批號(hào)RP180903）、異綠原酸C（批號(hào)RP180704）均購(gòu)自成都麥德生科技有限公司。4 批厚藤信息見(jiàn)表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室譚勇教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫，程序見(jiàn)表 2；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇制成含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質(zhì)量濃度分別為0.150 6、0.801 3、0.144 4、0.180 1、0.645 3、1.485 0、2.442 0、1.258 0 mg／mL的混合對(duì)照品貯備液，分別精密量取0.40、0.70、1.00、1.30、1.60 mL 至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2.2 供試品溶液 取厚藤粗粉（過(guò)2 號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞磨口錐形瓶中，精密量取70%甲醇20 mL 置錐形瓶中，稱定質(zhì)量并記錄，回流1 h，取出放涼后，再加70% 甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。理論板數(shù)以綠原酸計(jì)，不得低于6 000。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 8 種成分含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察 取適量“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照品溶液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.3%、0.2%、0.2%、0.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取厚藤粉末（過(guò)2 號(hào)篩，編號(hào)S1）約2 g，共6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為1.4%、0.9%、1.1%、1.2%、1.5%、0.8%、1.1%、1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取厚藤粉末（過(guò)2 號(hào)篩，編號(hào)S1）約2 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 1.7%、2.7%、2.1%、2.0%、3.0%、1.3%、2.9%、1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取厚藤粉末（過(guò)2 號(hào)篩，編號(hào)S1）約1 g，平行稱取6 份，按照100%水平精密加入對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.6 含量分析 取4 批樣品的5 個(gè)部位（花、葉、果實(shí)、嫩莖、老莖），共20 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5，可知老莖中咖啡酸含量最高，其他7 種成分含量均在葉中最高。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

3 討論與結(jié)論

分別考察了提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇回流提取1 h 提取率最高。以色譜峰的分離度、峰形、峰面積等為指標(biāo)考察了液相流動(dòng)相系統(tǒng)、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)效果最佳；327 nm 下各組分有最大吸收，靈敏度高；柱溫對(duì)結(jié)果影響不大，因此選擇接近室溫的25 ℃。

目前，關(guān)于厚藤不同部位比較研究的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究建立HPLC 法測(cè)定4 批厚藤5 個(gè)部位中8 種成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中老莖中咖啡酸含量最高，其他7 種成分含量均在葉中最高。綜上所述，本研究可為厚藤的質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用，以及相關(guān)資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents（%）