繆芝碩，鐘益玲，李海麗，吳 倩，鄺 鼎，唐偉卓?

（1.長(zhǎng)沙學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410022；2.湖南洋利農(nóng)林科技有限責(zé)任公司，湖南岳陽(yáng) 414400）

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果實(shí)，是一種常見的藥食同源藥材，廣泛應(yīng)用于特色茶飲和各種復(fù)方制劑中，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效［1-2］。傳統(tǒng)醫(yī)書記載，梔子除果實(shí)可入藥外，其根部、枝、葉均可入藥，用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛等［3-4］。

梔子作為一種藥食兩用的資源，在我國(guó)產(chǎn)量十分豐富，主產(chǎn)于江西、湖北、湖南、浙江、廣西等地，化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜、二萜、三萜、黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖及各種微量元素等［5-7］。目前，對(duì)梔子的研究主要集中在傳統(tǒng)用藥部位果實(shí)上［8-11］，其他部位的成分報(bào)道較少。在采摘梔子果實(shí)的過(guò)程中，枝葉多被丟棄或焚燒，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。有研究發(fā)現(xiàn)，梔子枝中含有一定環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類等活性成分［12-13］，但有關(guān)其系統(tǒng)全面的定性分析，以及多指標(biāo)成分的同時(shí)含量測(cè)定仍然比較缺乏?；诖?，本研究采用HPLC-MS法對(duì)梔子枝化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，并建立HPLCDAD 法同時(shí)測(cè)定7 種成分的含量，以期為梔子不同部位的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、Q Exactive 軌道阱質(zhì)譜（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；Waters alliance e2695 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；KQ-400DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TMT-3 型電子天平（0.01 g，湖南湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；New-Classic MS 型電子天平（0.000 01 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；103B 型高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永利制藥機(jī)械有限公司）；101A-2B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠股份有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 材料 梔子干燥枝條于2019 年7 月由湖南洋利農(nóng)林科技有限責(zé)任公司提供，經(jīng)長(zhǎng)沙學(xué)院陳建榮教授鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis 的枝條，現(xiàn)保存于長(zhǎng)沙學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院小分子天然產(chǎn)物研究實(shí)驗(yàn)室（ZZ001）。乙腈、甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。去乙酰基車葉草苷酸（批號(hào)MUST-19051720）、京尼平苷酸（批號(hào)MUST-19032203）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號(hào)MUST-19030201）、梔子苷（批號(hào)MUST-18103012）對(duì)照品（純度≥98%）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；京尼平龍膽雙糖苷（批號(hào)P27S10F96112）、去甲基川陳皮素（批號(hào)W15A10Z95342）、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚（批號(hào)P30A10S87217）對(duì)照品（純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 HPLC-DAD 樣品預(yù)處理 精密稱取梔子枝條粉末（過(guò)40 目篩）1.0 g，置50 mL 錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，精密稱定質(zhì)量，超聲（400 W、40 kHz）提取45 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，上清液用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2 HPLC-MS 樣品預(yù)處理 梔子枝粉碎，過(guò)40 目篩。取50 mg，加入800 μL 80%甲醇，渦旋30 s 混勻，4 ℃下超聲提取30 min，-20 ℃下靜置1 h，4 ℃、12 000 r／min 下離心15 min，取200 μL上清于進(jìn)樣小瓶中待檢。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取去乙?；嚾~草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，按一定比例稀釋制備成含上述對(duì)照品272.0、63.20、572.0、4.320、24.70、0.480 0、2.400 μg／mL 的溶液，即得。

2.3 分析條件

2.3.1 HPLC-DAD 色譜條件 YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×10 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～18 min，5%～15%A；18～30 min，15%～33%A；30～40 min，33%～60% A；40～50 min，60%～95% A；50～51 min，95%～5% A；51～60 min，5% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；DAD 檢測(cè)器采集范圍200～800 nm；檢測(cè)波長(zhǎng)254、330 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 HPLC-MS 分析條件

2.3.2.1 HPLC Hyper gold C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸水（A）-0.1% 甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～1.5 min，100%～80% A；1.5～9.5 min，80%～0A；9.5～14.5 min，0A；14.5～14.6 min，100% A；14.6～18 min，100%A）；體積流量0.35 mL／min；柱溫40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2.2 MS 電噴霧離子源；正離子模式，加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量15 L／min；輔助氣體積流量5 L／min；尾氣體積流量0.33 L／min；電噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；一級(jí)全掃描（m／z70～1 050）；分辨率70 000；碰撞模式，高能量碰撞解離（HCD）。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0 mL，逐級(jí)稀釋，制備成系列不同質(zhì)量濃度的5 份溶液。精密吸取10 μL，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。分別以去乙酰基車葉草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次，測(cè)得去乙?；嚾~草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚峰面積RSD 分別為2.37%、3.79%、3.60%、2.51%、2.61%、1.54%、1.43%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下于0、1、3、5、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得去乙?；嚾~草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚峰面積RSD 分別為1.96%、3.80%、3.42%、3.79%、2.76%、1.51%、1.13%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品1.0 g，共5 份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得去乙?；嚾~草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚峰面積RSD 分別為2.07%、3.88%、3.72%、2.52%、2.61%、2.55%、2.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一批樣品1.0 g，共9 份，每3 份加入含去乙?；嚾~草苷酸（68.00 μg／mL）、京尼平苷酸（15.80 μg／mL）、竹節(jié)參皂苷Ⅳa（143.0 μg／mL）、京尼平龍膽雙糖苷（1.080 μg／mL）、梔子苷（6.170 μg／mL）、去甲基川陳皮素（0.119 0 μg／mL）、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚（0.600 0 μg／mL）的混合對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果，去乙?；嚾~草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚平均加樣回收率分別為101.90%、98.84%、99.56%、98.96%、100.67%、97.69%、100.44%，RSD 分別為2.18%、2.36%、3.03%、2.51%、2.34%、1.96%、2.46%。

2.6 HPLC-MS 定性分析 采用Compound discoverer軟件對(duì)LC-MS 檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行提取分析，通過(guò)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息推導(dǎo)其可能的分子式，物質(zhì)二級(jí)檢測(cè)采用HCD 碰撞。通過(guò)主要碎片離子與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)對(duì)比、相關(guān)文獻(xiàn)檢索及對(duì)照品分析，從總離子流圖中鑒定出30 個(gè)化合物，包括黃酮類7 個(gè)、萜類10 個(gè)、小分子芳香類6 個(gè)、有機(jī)酸2 個(gè)、其他類5 個(gè)?？傠x子流色譜圖見圖1，具體信息見表2。

圖1 梔子枝各成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of various constituents in the stems of G.jasminoides

結(jié)果，鑒定了7 個(gè)黃酮類化合物，分別為峰10、11、12、13、14、17、18，主要結(jié)構(gòu)類型為蘆丁、山柰酚、槲皮素及其苷元的衍生物。一般來(lái)說(shuō)，黃酮苷元的質(zhì)譜裂解容易丟失CO，而黃酮苷類常存在糖片段及H2O 的中性丟失。峰12 在正離子模式下母核離子為m／z611 ［M+H］+，二級(jí)質(zhì)譜中可見m／z303 ［M+H-C6H10O4-C6H10O5］+的碎片離子，質(zhì)量丟失308，為脫去一分子蕓香糖的特征信號(hào)，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，與對(duì)照品對(duì)比，鑒定為蘆丁；峰14 正離子模式下母核離子為m／z303［M+H］+，二級(jí)質(zhì)譜中可見m／z285 ［M-H2O］+、275 ［M-CO］+、257 ［M-CO-H2O］+特征性碎片離子，以及由m／z257 經(jīng)重排并丟失CO 的碎片離子m／z229，上述裂解規(guī)律與文獻(xiàn)［14］一致，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)照品對(duì)比，鑒定為槲皮素；峰15 母核離子為m／z287 ［M+H］+，與峰14 相比分子量缺少m／z16，提示可能為少一個(gè)羥基的衍生物，同時(shí)二級(jí)質(zhì)譜中觀察到m／z241 及其丟失一個(gè)CO 的碎片離子m／z213，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)照品對(duì)比鑒定為山柰酚；峰13 也可以觀察到m／z257、229 特征碎片離子，通過(guò)文獻(xiàn)［15］及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比鑒定為異鼠李素；峰17 可以觀察到母離子m／z273 及特征碎片離子m／z119，經(jīng)文獻(xiàn)［16］對(duì)比和對(duì)照品分析鑒定為柚皮素；通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，峰18 鑒定為香葉木素。另外，峰14 在一級(jí)質(zhì)譜中可見m／z291 ［M+H］+母離子峰，二級(jí)質(zhì)譜中觀察到有m／z273 ［M+H-H2O］+、247 ［M+H-COO］+，以及環(huán)開裂產(chǎn)生的m／z206 ［M+H-COO-C3H5］+離子，低場(chǎng)還可見m／z165、147 碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)［17］、數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照品分析，鑒定為兒茶素。

表2 梔子枝各成分LC-MS 分析結(jié)果Tab.2 Analysis results of various constituents in the stems of G.jasminoides by LC-MS

本實(shí)驗(yàn)所鑒定的萜類多數(shù)為小分子單萜及倍半萜，這類小分子極性較弱，主要通過(guò)二級(jí)碎片及數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行鑒定，如峰7、20、21、22、23、25。此外，還鑒定了極性萜類化合物，峰4 在上述條件下可觀察到m／z373 的母離子，以及丟失一個(gè)葡萄糖分子m／z162 后的碎片離子m／z211，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)［18］、對(duì)照品比對(duì)，鑒定為京尼平苷酸；峰29 和30 顯示相同的母離子m／z475［M+H］+，提示兩者為一對(duì)同分異構(gòu)體，二級(jí)質(zhì)譜顯示有m／z249、203、109 等碎片信息，通過(guò)二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配及對(duì)照品比對(duì)，分別鑒定為齊墩果酸和熊果酸。

峰8 可見m／z353 母離子碎片，其二級(jí)質(zhì)譜碎片中存在m／z161 碎片離子，對(duì)應(yīng)其咖啡酸片段中丟失水分子后的碎片特征，經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)［19］、對(duì)照品比對(duì)，鑒定為綠原酸。另外，其他類小分子芳香化合物的結(jié)構(gòu)鑒定主要是通過(guò)將其質(zhì)譜一級(jí)數(shù)據(jù)、二級(jí)碎片離子信息與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配完成。

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 HPLC 色譜圖 在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖2～3。

圖2 對(duì)照品各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents in reference substance

2.7.2 樣品含量測(cè)定 取同一批樣品粉末1.0 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL，計(jì)算含量。結(jié)果，去乙酰基車葉草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲基川陳皮素、櫟精-3，7，3′，4′-四甲醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.140、0.665、3.575、0.003、0.164、0.001、0.002 mg／g。

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化 為了比較不同提取溶劑的提取效果，以30%、50%、70%、100%甲醇及30%、50%、70%、100% 乙醇作為提取溶劑，分別超聲35、45、55 min，并計(jì)算提取率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以甲醇為溶劑超聲45 min 時(shí)，提取率最高。故確定甲醇為溶劑，超聲45 min 前處理樣品。

3.2 流動(dòng)相選擇 分別采用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行等度和梯度洗脫。結(jié)果表明，在乙腈-0.1%磷酸溶液的流動(dòng)相中，各色譜峰分布、峰形和分離度均優(yōu)于甲醇-水（酸水）系統(tǒng)。因此，最終選擇乙腈-0.1% 磷酸溶液為流動(dòng)相。

3.3 色譜條件及波長(zhǎng)選擇 基于文獻(xiàn)［20］報(bào)道方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)際樣品分析中，在33% 乙腈洗脫下，所有環(huán)烯醚萜類成分均已出峰。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，由于單一波長(zhǎng)難以全面反映梔子枝中化學(xué)成分組成的全貌，故本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器對(duì)梔子樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（200～800 nm），對(duì)各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類的最大吸收波長(zhǎng)分別為254、330 nm，所以本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)分別選擇254、330 nm。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，竹節(jié)參皂苷Ⅳa 在梔子枝中最高，也比在果中的要高［12］；去乙?；嚾~草苷酸是梔子枝中主要存在的環(huán)烯醚萜類成分，含量與梔子果部位相當(dāng)［20］，其次為京尼平苷酸和梔子苷，而京尼平龍膽雙糖苷含量最低。

圖3 樣品各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents in samples

4 結(jié)論

梔子傳統(tǒng)以果實(shí)入藥。目前，相關(guān)研究也主要集中在果實(shí)部位，有關(guān)其他部位的化學(xué)成分及資源化分析研究較少。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)梔子枝中的化學(xué)成分進(jìn)行LC-MS 定性分析，隨后對(duì)其進(jìn)行HPLCDAD 定量測(cè)定。結(jié)果表明，梔子枝成分多樣性較為豐富，包含黃酮、萜類及有機(jī)酸等多種結(jié)構(gòu)類型，具有一定的研究意義。含量測(cè)定結(jié)果提示，梔子枝在一定程度上可以作為去乙?；嚾~草苷酸、京尼平苷酸、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 等化合物的新來(lái)源，結(jié)合中藥材“一體多用”原則，以期為梔子非傳統(tǒng)藥用部位的開發(fā)利用和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。