李玉霞 史正剛?吳麗萍祁 輝陳 靜

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，甘肅蘭州 730000）

西醫(yī)認為，小兒厭食癥發(fā)病因素復(fù)雜多樣，包括飲食結(jié)構(gòu)不合理、局部或系統(tǒng)性疾病、微量元素缺乏、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸運動失調(diào)、藥物和激素類物質(zhì)影響等［1-3］，而直接機制在于消化酶活性減少、食欲調(diào)節(jié)中樞失調(diào)、攝食調(diào)節(jié)關(guān)鍵區(qū)域功能異常、食欲調(diào)節(jié)因子分泌紊亂等［4-5］；中醫(yī)認為，喂養(yǎng)不當、飲食不節(jié)是導(dǎo)致小兒脾胃損傷的主要原因，加上脾胃受損、先天不足、后天失養(yǎng)、生活環(huán)境等因素及小兒“脾常不足”的生理特點，易造成脾運胃納功能失健，從而形成厭食［6-7］。長期厭食癥將造成小兒營養(yǎng)不良，影響生長發(fā)育，導(dǎo)致其免疫力下降，使其他系統(tǒng)疾病的易感性增加。

西醫(yī)治療小兒厭食癥的方法包括心理輔導(dǎo)、補鋅、促進胃腸動力藥等，但只能改善癥狀，不能解決根本問題，并且長期使用會出現(xiàn)一些不良反應(yīng)；中醫(yī)治療方法為運脾法，在臨床上取得了較好的療效，克服了西醫(yī)片面補鋅所帶來的不良反應(yīng)［8］。其中，小兒開胃增食合劑作為運脾法治療小兒厭食癥的代表中藥制劑，臨床上表現(xiàn)出顯著效果［9］，但其干預(yù)機制尚不清楚。

研究表明，小兒厭食癥患者體內(nèi)物質(zhì)代謝可發(fā)生明顯變化，主要是由于攝食不足導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)缺失，使得各細胞、器官、系統(tǒng)代謝失調(diào)，并又通過影響自身功能的正常運行而進一步加重癥狀，形成惡性循環(huán)［10］。代謝物作為基因、蛋白網(wǎng)絡(luò)運行的下游最終產(chǎn)物，其變化可反映上游基因、蛋白水平代謝通路的變化，故本實驗通過代謝組學(xué)檢測尿液中代謝物、代謝通路的變化，探索小兒開胃增食合劑治療小兒厭食癥的作用機制，為相關(guān)臨床治療提供數(shù)據(jù)參考和理論支持。

1 材料

1.1 動物 60 只離乳后1 周齡SPF 級健康SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（80±10）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物使用許可證號SYXK（甘）2015-0005-62001000000354。

1.2 藥物 小兒開胃增食合劑（批號甘藥制字Z09011932）由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供；江中健胃消食片（國藥準字Z36021464，批號17031001）購自江中藥業(yè)股份有限公司。

1.3 儀器 LC-MS 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Thermo 公司，型號Ultimate 3000LC，Orbitrap Elite）；低溫離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司，型號TGL-16）；超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司，型號DW-HL528）。

2 方法

2.1 造模 采用病因模擬法建立厭食癥模型［11］，特制飼料為將魚肉松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉按1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2 比例混勻，制成餅狀，晾干，4 ℃下保存。造模組大鼠喂養(yǎng)特制飼料，對照組僅常規(guī)喂養(yǎng)，記錄每天進食量，以造模組大鼠攝食量平均下降20%～30%、體質(zhì)量低于對照組10%～15%為造模成功。

2.2 分組及給藥 將造模組大鼠隨機分為模型組、陽性對照組及小兒開胃增食合劑高、低劑量組，每組12 只，按兒童、大鼠體質(zhì)量的劑量倍數(shù)直接換算成等效劑量，其中小兒開胃增食合劑高劑量組（0.3 g 生藥／mL）以11.4 g／kg 劑量灌胃，低劑量組以5.7 g／kg 劑量灌胃；陽性對照組以0.45 g／kg江中健胃消食片溶液灌胃；正常組、模型組以等體積蒸餾水灌胃，每天1 次，連續(xù)42 d，

2.3 攝食量、體質(zhì)量檢測 記錄每天大鼠體質(zhì)量、飼料剩余量、當日飼料加入量，每天大鼠攝食量＝前天飼料加入量-當天飼料剩余量，計算大鼠每天攝食量，并在灌胃前后進行對比。

2.4 尿樣采集 末次給藥結(jié)束后，將大鼠置于清潔代謝籠中，在冰上用裝有1 mL 0.1% 疊氮化鈉（NaN3）的一次性塑料尿杯收集24 h 尿液，移液槍采集1.5 mL 上清液后轉(zhuǎn)移至離心管中，進行編號和記錄，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 樣品處理 室溫下解凍尿液后，取100 μL 至1.5 mL 離心管中，加入甲醇300 μL、2-氯苯丙氨酸（內(nèi)標）10 μL，混勻后在4 ℃下離心（12 000 r／min）15 min，取200 μL 上清液待測。

2.6 樣品分析

2.6.1 色譜條件 Hypergod C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相水（含0.1% 甲酸）（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫，程序見表 1；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL；自動進樣器溫度4 ℃。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.6.2 質(zhì)譜條件 正、負離子模式下除了電噴霧電壓分別為3.0、3.2 kV，S-Lens RF Level 分別為30%、60%外，其余條件均為加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量45 arb；輔助氣體積流量15 arb；尾氣體積流量1 arb；毛細管溫度350 ℃。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究根據(jù)等量提取后樣本混合而成QC 樣本的LC-MS 數(shù)據(jù)重復(fù)性來評價儀器穩(wěn)定性，分析數(shù)據(jù)質(zhì)量，并為后續(xù)樣品預(yù)處理參數(shù)設(shè)定提供依據(jù)。依據(jù)QC 樣本的保留時間和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，對Markerview 參數(shù)進行設(shè)置，再將LC-MS 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件中進行色譜峰校準，尋找相應(yīng)色譜峰及離子強度。根據(jù)80%原則及去除同位素離子獲取有意義的連續(xù)性變量，歸一化色譜峰總面積。采用SIMCA-P 13.0 軟件對上述處理后的數(shù)據(jù)進行分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），其中在OPLSDA 分析中得到投射變量影響值（variable importance in projection，VIP），結(jié)合在Markerview軟件中得到的t檢驗P值和倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）值來篩選差異代謝物，并以同時滿足VIP＞1，P＜0.05 和FC＞2 為標準篩選差異代謝物。以質(zhì)譜質(zhì)荷比或精確分子質(zhì)量為指標搜索在線數(shù)據(jù)庫Metlin，對代謝差異物進行定性分析。采用Multiple Array Viewer 軟件，對包含峰強度信息的已鑒定差異代謝物的數(shù)據(jù)集進行HCA 分析，并生成熱圖，并通過Metabolo Analyst 3.0 軟件結(jié)合相關(guān)文獻報道對代謝通路進行分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠攝食量、體質(zhì)量 與正常組比較，造模第7 天模型組大鼠攝食量、體質(zhì)量分別降低37.5%、19.0%（P＜0.05），第28 天分別降低至40.6%、30.0%（P＜0.05），符合厭食癥模型標準，提示造模成功［12-13］。見表2。

表2 各組大鼠攝食量、體質(zhì)量變化（，g）Tab.2 Changes in food intakes and body weights of rats in various groups（，g）

表2 各組大鼠攝食量、體質(zhì)量變化（，g）Tab.2 Changes in food intakes and body weights of rats in various groups（，g）

注：與正常組比較，?P＜0.05。

3.2 系統(tǒng)穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗 對QC 樣品的總離子流色譜圖（TIC）色譜圖進行重疊，結(jié)果見圖1。由此可知，代表性離子色譜峰強度的RSD 均小于10%，TR 漂移均小于0.25 min，m／z波動范圍不超過0.000 007，表明保留時間重復(fù)性、儀器穩(wěn)定性良好，所得結(jié)果具有較高的可靠性。

3.3 LC-MS 代謝譜 圖2 顯示，各組總離子色譜圖的輪廓具有一定差異。再采用SIEVE 軟件，對正、負離子模式下的色譜數(shù)據(jù)進行提取和預(yù)處理，并在Excel 2010 中進行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包括保留時間（RT）、分子量（CompMW）、觀察量（樣本名稱）、質(zhì)荷比（m／z）、可提取物質(zhì)數(shù)（ID）、峰強度等信息。本實驗在正離子模式下共得到1 539 個代謝物，負離子模式下得到4 016 個代謝物，將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 13.0 軟件進行多元統(tǒng)計分析，找出組間具有表達差異的物質(zhì)。

3.4 主成分分析（PCA）圖3 顯示，正、負離子模式下各組代謝物的總體分布均比較集中，無明顯偏離的組，即無法分辨出各組之間代謝變化的總體差異。因此，本研究采用具有更大區(qū)分能力的OPLS-DA 進行數(shù)據(jù)建模。

圖1 QC 樣品總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of QC samples

3.5 偏最小二乘方判別分析（OPLS-DA）圖4顯示，與正常組比較，模型組大鼠尿液中代謝物有明顯變化；與模型組比較，小兒開胃增食合劑各劑量組大鼠尿液中代謝物有明顯變化。選擇OPLSDA 模型的VIP＞1，并結(jié)合P＜0.05 且log2FC＞1 或log2FC＜-1 作為差異代謝物的篩選標準，結(jié)合質(zhì)荷比或精確分子質(zhì)量搜索在線數(shù)據(jù)庫Metlin，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組中明顯下調(diào)的代謝物有22 個，明顯上調(diào)的代謝物有7 個，其中顯著下調(diào)的有11 個［Xanthosine、LysoPE（0∶ 0／20∶ 4）、m-Coumaric acid、cAMP、Palmitic acid、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Phloroglucinol、6-Phosphog-gluconolactone、Tartaric acid、Hexadecanedioic acid］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），無顯著上調(diào)的（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1）見表3、圖 5；與模型組比較，小兒開胃增食合劑低劑量組中明顯上調(diào)的代謝物有15 個，明顯下調(diào)的代謝物有14 個，其中顯著上調(diào)的有3 個（5-Methoxytryptophan、Suberic acid、N-Acetylleucine）（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1），顯著下調(diào)的有3 個［Oleic Acid、LysoPE（0∶ 0／18∶ 1）、Palmitic acid］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），見表3、圖 5；小兒開胃增食合劑高劑量組中明顯上調(diào)的代謝物有29 個，明顯下調(diào)的代謝物有19 個，其中顯著上調(diào)的有10 個（L-Homophenylalanine、Sinapic acid、2-Acetolactic acid、Ricinoleic acid、Suberic acid、3-Indoleacetic Acid、6-Phospho-g-gluconolactone、Oxaloglutarate、Mesaconic acid、N-Acetylleucine ）（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＞1），顯著下調(diào)的有6 個 ［LPA（0∶0／18∶0）、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Palmitic acid、Stearic acid、γ-Tocotrienol］（VIP＞1.0，P＜0.05 且log2FC＜-1），見表3、圖5。

3.6 代謝通路分析及其生物學(xué)意義 將有明顯差異的代謝物名稱及相對色譜峰強度數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboloAnalyst 3.0 軟件中進行代謝通路匹配分析，結(jié)果見圖6～7。由此可知，與正常組比較，模型組具有明顯差異的29 個代謝物所涉及到的代謝通路有9 條，主要受到影響的通路包括非飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成、苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝；與模型組比較，小兒開胃增食合劑低劑量組主要是非飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代謝通路受到影響，而高劑量組主要是非飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代謝、苯丙氨酸代謝受到影響，主要涉及到氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝。

圖3 各組大鼠代謝物PCA 圖Fig.3 PCA plots for metabolites of rats in various groups

圖4 各組大鼠代謝物OPLS-DA 圖Fig.4 OPLS-DA plots for metabolites of rats in various groups

表3 各組大鼠尿液中14 種生物標志物Tab.3 Fourteen biomarkers in rat urine in various groups

圖6 具有明顯差異代謝物的代謝通路（ESI-）Fig.6 Metabolic pathways of metabolites with significant differences（ESI-）

4 討論

本研究采用病因模擬法成功制備了厭食癥模型大鼠，通過LC-MS 法對其尿液中代謝物進行代謝組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)有29 個代謝物發(fā)生了變化，涉及9 條代謝通路；藥物干預(yù)后，與模型組比較，小兒開胃增食合劑低劑量組、高劑量組大鼠分別有29、48 個代謝物發(fā)生變化，分別涉及14、19 條代謝通路，主要是脂質(zhì)、氨基酸代謝途徑。

圖7 具有明顯差異代謝物的代謝通路（ESI+）Fig.7 Metabolic pathways of metabolites with significant differences（ESI+）

4.1 潛在代謝標志物 模型組大鼠尿液中具有意義的差異代謝物包括Xanthosine、LysoPE（0∶0／20∶ 4）、m-Coumaric acid、cAMP、Palmitic acid、Oleic Acid、LysoPE（0∶0／18∶1）、Phloroglucinol、6-Phosphogluconolactone、Tartaric acid、Hexadecanedioic acid，提示小兒厭食癥模型大鼠代謝發(fā)生了明顯變化，可作為臨床診斷和評價的代謝標志物候選因子，但還需利用分子生物學(xué)手段證實。

4.2 脂質(zhì)代謝途徑 脂質(zhì)代謝是機體維持脂類物質(zhì)平衡，影響機體正常運行的主要代謝之一［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠尿液中脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)物質(zhì)LPA（0∶ 0／18∶ 0）、Palmitic acid、Oleic Acid、Tartaric acid 水平均顯著下降，其中Palmitic acid、Oleic Acid、Tartaric acid 均屬于脂肪酸生物合成通路的產(chǎn)物，LPA（0∶0／18∶0）屬于甘油磷脂代謝的產(chǎn)物，其濃度下降分別預(yù)示體內(nèi)脂肪酸生物合成、甘油磷脂代謝通路受阻，小兒身體對脂質(zhì)的吸收、利用、代謝發(fā)生障礙，但小兒開胃增食合劑干預(yù)后這2 條代謝途徑并未發(fā)生回調(diào)，反而向更失調(diào)的方向移動，其原因可能是藥物本身對脂質(zhì)代謝通路的失調(diào)作出了貢獻，并且也是脂肪酸代謝受阻時機體對高脂高糖飼養(yǎng)的一種保護改變策略。

4.3 氨基酸代謝途徑 氨基酸代謝在小兒厭食癥模型大鼠中失調(diào)，其中苯丙氨酸代謝通路的產(chǎn)物苯乙醛在模型組中下調(diào)，而經(jīng)小兒開胃增食合劑干預(yù)后上調(diào)。苯丙氨酸作為人體必需的氨基酸，它在模型組中代謝下調(diào)可能是由于厭食造成其攝入減少所致，而干預(yù)后其代謝上調(diào)可能是由于小兒開胃增食合劑可改善癥狀，使其攝入量趨于正常。

4.4 其他 其他物質(zhì)代謝及其通路在各組大鼠中呈非線性系統(tǒng)性變化，具體原因還需進一步研究。