彭 艷，白 雪，馮文戰(zhàn)，劉 祎，郭 佳，高 立

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科，四川瀘州 646000）

缺血性卒中是由各種原因?qū)е戮植磕X組織血液供應(yīng)障礙，造成神經(jīng)元損傷、神經(jīng)功能缺損。緩解由腦缺血引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要方法是迅速恢復(fù)缺血區(qū)域的血流［1］，但血液再灌注會增加興奮性氨基酸、氧自由基、細胞內(nèi)Ca2+產(chǎn)生，均可對腦組織造成額外的損傷，即腦缺血再灌注損傷，其發(fā)生發(fā)展涉及多個信號通路的變化。其中，磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydrxy kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）-內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信號通路廣泛參與調(diào)節(jié)細胞活化，炎癥反應(yīng)、細胞凋亡，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用［2-3］。

研究表明，中藥及其單體可通過多種途徑作用于多個靶點，從而防治腦缺血再灌注損傷［4］。本實驗基于古方補陽還五湯，重用黃芪及具有辛味、開通玄府的藥物（如水蛭、全蝎）組成加味益氣通玄方，并基于PI3K／Akt-eNOS 信號通路探討該方對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，以期為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 72 只SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2015-030，動物使用許可證號SYXK（川）2014-189。實驗通過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準，批號2019284A，其間盡量減少動物痛苦。

1.2 儀器 RM2016 切片機購自德國徠卡公司；BMJ-III 型包埋機、TSJ-II 全自動封閉式組織脫水機、PHY-III 型病理組織漂烘儀均購自常州中威電子儀器廠；AE31 倒置顯微鏡購自廈門麥克奧迪實業(yè)有限公司；JY200C 電泳儀、JY-SCZ4+垂直電泳槽均購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 試劑與藥物 加味益氣通玄方的成人單日用量為155 g 生藥，由80 g 黃芪（批號19080063）、12 g 當歸（批號19110059）、12 g 川芎（批號19100192）、12 g 赤芍、10 g 地龍（批號19070217）、10 g 桃仁（批號18110108）、10 g 紅花（批號19090095）、6 g 水蛭（批號18050159）、3 g 全蝎（批號17050133）組成，上述藥材購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑室制備中藥湯劑濃縮液。氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自美國Sigma-Aldrich 公司（貨號T8877，批號BCBX0337）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自瑞士 Roche 公司（貨號 11772465001，批號37412800）；裂解液購自上海雅酶生物科技有限公司（貨號PC101，批號012B1050）；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號23227，批號TG268825）、ECL 顯影試劑盒（貨號32109，批號TF269 477 A）購自美國 Thermo 公司；抗 Akt（ab8805 ）、p-Akt（ab38449 ）、eNOS（ab76198 ）、p-eNOS（ab184154）、Bcl-2（ab32124）、Bax（ab32503）、cleaved-Caspase3（ab32042）、β-actin（ab5694）的一抗，以及辣根過氧化物酶標記的二抗（ab205718）購自英國Abcam 公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 72 只大鼠經(jīng)1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為假手術(shù)組，模型組，阿司匹林組及加味益氣通玄方高、中、低劑量組，每組12 只。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注模型［5］，方法為術(shù)前禁食12 h、禁水4 h，4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿頸部正中線縱向切口，分離右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA），分別結(jié)扎CCA 近心端、ECA 和ICA 近分叉出打活結(jié)，在CCA 近分叉處剪一倒“V”型切口，插入線栓，于插入線栓處用備用線結(jié)扎（以不出血為度），松開ICA 處活結(jié)，緩慢推送線栓和栓線，線栓進入ICA 后調(diào)整線栓頭端向內(nèi)向上，有阻力時停止推進，此時線栓頭端正好處于大腦中動脈（MCA）起始部，造成阻斷，缺血2 h后輕柔拔出線栓；假手術(shù)組僅進行頸部血管分離，不插入線栓，造模完成2 h 后大鼠出現(xiàn)對側(cè)偏癱，可認為造模成功。造模24 h 后，阿司匹林組以60 mg／kg 劑量灌胃給藥，每天1 d，連續(xù)14 d；加味益氣通玄方成人單日用量為155 g，而大鼠和人用藥劑量的折算系數(shù)為6.25，假設(shè)人體質(zhì)量為70 kg，故大鼠正常劑量為13.84 g／kg，作為中劑量組，高、低劑量組分別為中劑量組的2、0.5 倍，即27.68、6.92 g／kg，分別灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)14 d；假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)14 d。

2.2 神經(jīng)缺損評分檢測 于給藥后第3、7、14 天，除假手術(shù)組外各組隨機選取8 只大鼠，根據(jù)Chen 等［6］報道的修正版神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）進行神經(jīng)功能評價，主要內(nèi)容包括運動實驗（提尾實驗0～3 分、行走實驗0～3 分）、感覺實驗（放置實驗1 分、本體感覺實驗1 分、平衡實驗0～6分）、反射喪失和不正常運動（耳廓反射1 分、角膜反射1 分、驚恐反射1 分）及癲癇、肌陣攣、肌張力障礙（各1 分），總分18 分，分數(shù)越高，神經(jīng)功能缺損越嚴重。

2.3 腦梗死體積比例檢測 第7 天，各組隨機取3 只大鼠麻醉取腦，額葉切片2 mm，2%TTC 染色15 min，缺血性梗塞區(qū)域被染成白色，非缺血性梗塞區(qū)域被染成紅色，拍攝圖像，通過Image J 軟件計算腦梗死面積、腦組織總面積（腦梗死面積＝對側(cè)半球面積-梗死側(cè)半球正常組織面積），兩者乘以切片厚度即為腦梗死體積、全腦體積，腦梗死體積比例＝（腦梗死體積／全腦體積）×100%。

2.4 腦組織病理學(xué)觀察和凋亡測定 將大鼠腦組織制成石蠟組織切片（厚度4 μm），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。再根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書進行腦組織凋亡檢測，根據(jù)陽性細胞數(shù)量計算細胞凋亡率。

2.5 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗 收集大鼠梗塞區(qū)域的皮質(zhì)組織，裂解液充分裂解組織，提取總蛋白，BCA 蛋白測定試劑盒測定濃度，進行聚丙烯酰氨凝膠電泳蛋白電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5% 脫脂牛奶封閉1 h，并與Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3 蛋白的一抗在4 ℃下孵育過夜，將膜與耦聯(lián)有辣根過氧化物酶的二抗孵育，ECL 使條帶可視化。以β-actin 為內(nèi)參，對結(jié)果進行均一化處理。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析（ANOVA），多重比較采用最小顯著性差異法（LSD）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能評分 第3 天，與模型組比較，阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組神經(jīng)功能評分均降低（P＜0.01），加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組均高于加味益氣通玄方高劑量組（P＜0.01）。第7 天，各給藥組神經(jīng)功能評分均低于模型組（P＜0.01），加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方中劑量組、高劑量組（P＜0.01）。第14 天，各給藥組神經(jīng)功能評分均低于模型組（P＜0.01），加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方高劑量組（P＜0.01）。各組大鼠神經(jīng)功能評分均隨時間延長均呈下降趨勢。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分（分，， n＝8）Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups（score，， n＝8）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分（分，， n＝8）Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups（score，， n＝8）

注：與模型組比較，??P＜0. 01；與加味益氣通玄方高劑量組比較，＄＄P＜0. 01；與加味益氣通玄方中劑量組比較，＆＆P＜0.01。

3.2 大鼠腦組織相對梗死體積 正常大鼠腦組織呈紅色，TTC 染色后變?yōu)榘咨?。與模型組比較，阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組、加味益氣通玄方中劑量組大鼠相對梗死體積降低（P＜0.05，P＜0.01）；與加味益氣通玄方高劑量組比較，加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組大鼠相對梗死體積升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色及相對梗死體積Fig.1 TTC staining and relative infarct volumes of brain tissue in rats in various groups

3.3 大鼠腦組織病理損傷 假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞胞核形態(tài)和數(shù)量正常，核大而圓，核仁清晰，胞質(zhì)染色均勻，部分胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體清晰，未見明顯壞死；模型組大鼠正常細胞數(shù)量減少，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不明顯，神經(jīng)纖維水腫變性，排列散亂，染色明顯變淺，細胞體積減小，周圍間隙增寬，細胞核固縮或溶解消失；加味益氣通玄方低劑量組、中劑量組大鼠可見部分神經(jīng)元變性或壞死；加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組大鼠偶見神經(jīng)元變性或壞死；各給藥組大鼠細胞與模型組比較，均排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織病理損傷Fig.2 Pathological injury of brain tissue in rats in various groups

3.4 大鼠腦組織細胞凋亡 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TUNEL 染色呈陽性的細胞數(shù)量上升，腦組織細胞凋亡率增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織細胞凋亡率均降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織細胞凋亡Fig.3 Cell apoptosis of brain tissue in rats in various groups

3.5 大鼠PI3K／Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達 PI3K／Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白Akt、eNOS 各組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-Akt／Akt、peNOS／eNOS 比值降低（P＜0.01）；與模型組比較，加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組p-Akt／Akt、p-eNOS／eNOS 比值升高（P＜0.05，P＜0.01），而加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組無明顯變化（P＞0.05）。見圖4。

此外，與假手術(shù)組比較，模型組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3 表達及Bax／Bcl-2 比值升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組Bcl-2 表達升高（P＜0.01），Bax、cleaved-Caspase3 表達量及Bax／Bcl-2 比值降低（P＜0.01）；加味益氣通玄方中劑量組Bcl-2 表達升高（P＜0.01），Bax／Bcl-2 比值下降（P＜0.01），Bax 表達量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），cleaved-Caspase3 表達降低（P＜0.05）；加味益氣通玄方低劑量組Bax／Bcl-2 比值降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠PI3K／Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.4 Expressions of PI3K／Akt-eNOS pathwayrelated proteinsandapoptosis-related proteins in rats in various groups

4 討論

本研究基于中醫(yī)玄府理論，結(jié)合目前中醫(yī)對中風(fēng)病的研究現(xiàn)狀，并依據(jù)古今醫(yī)家相關(guān)論述及現(xiàn)代研究，總結(jié)該病以“虛、風(fēng)、火、痰、瘀、毒”等為基本病機，確定玄府郁閉貫穿中風(fēng)發(fā)病的整個階段，以古方補陽還五湯為基礎(chǔ)，用黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、水蛭、全蝎九味中藥組成加味益氣通玄方。結(jié)果顯示，該方能有效緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，降低腦梗塞體積，改善皮質(zhì)區(qū)域病理變化，表明它能保護腦組織免受缺血再灌注損傷。

大量研究表明，細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷有關(guān)［7-9］?？沟蛲龅鞍譈cl-2、促凋亡蛋白Bax 定位于線粒體，響應(yīng)凋亡刺激，Bax 從細胞質(zhì)中的Bcl-2／Bax 異二聚體解離后Bax 易位到線粒體，刺激細胞色素C 釋放，并進一步激活了半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)，使Caspase3 裂解成活化的cleaved-Caspase3，最終導(dǎo)致細胞凋亡［10-11］，并且Bcl-2 與Bax 之間的動態(tài)平衡在腦缺血時的細胞命運中起著關(guān)鍵作用［12］。已有研究表明，腦缺血再灌注損傷可通過降低Bcl-2 表達、提高Bax 表達來加速生理性細胞凋亡［13-14］，本實驗也得到相似結(jié)果，表明加味益氣通玄方可以通過提高Bcl-2 表達，降低Bax、cleaved-Caspase3 表達及Bax／Bcl-2 比值來保護腦組織。

eNOS 可通過抑制促凋亡蛋白來發(fā)揮促增殖作用［15-18］，它產(chǎn)生的NO 對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，而作為其活性和缺血性損傷結(jié)果的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，磷酸化eNOS 常用于評估腦血管功能［19］，并且還能調(diào)控體內(nèi)腦血流量，改善慢性腦灌注不足引起的認知障礙［20］。eNOS 活性受多種機制調(diào)控，其中經(jīng)典信號通路PI3K／Akt 是調(diào)控其活化的關(guān)鍵途徑之一，故阻斷PI3K／Akt 可抑制其活性［21］。前期報道，與假手術(shù)大鼠比較，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中PI3K／Akt-eNOS 活性降低［8，22］；本研究也發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中p-Akt、p-eNOS 表達低于假手術(shù)組，而加味益氣通玄方干預(yù)后被重新激活。

綜上所述，加味益氣通玄方可緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，降低腦梗塞體積，改善皮質(zhì)區(qū)域病理變化，減失皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡，其機制可能是降低了Bax／Bcl-2 比值，激活PI3K／AkteNOS 通路。