彭 艷,白 雪,馮文戰(zhàn),劉 祎,郭 佳,高 立
(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,四川瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科,四川瀘州 646000)
缺血性卒中是由各種原因?qū)е戮植磕X組織血液供應(yīng)障礙,造成神經(jīng)元損傷、神經(jīng)功能缺損。緩解由腦缺血引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要方法是迅速恢復(fù)缺血區(qū)域的血流[1],但血液再灌注會(huì)增加興奮性氨基酸、氧自由基、細(xì)胞內(nèi)Ca2+產(chǎn)生,均可對(duì)腦組織造成額外的損傷,即腦缺血再灌注損傷,其發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)信號(hào)通路的變化。其中,磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydrxy kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)信號(hào)通路廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活化,炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡,在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[2-3]。
研究表明,中藥及其單體可通過多種途徑作用于多個(gè)靶點(diǎn),從而防治腦缺血再灌注損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)基于古方補(bǔ)陽還五湯,重用黃芪及具有辛味、開通玄府的藥物(如水蛭、全蝎)組成加味益氣通玄方,并基于PI3K/Akt-eNOS 信號(hào)通路探討該方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用,以期為臨床用藥提供依據(jù)。
1.1 動(dòng)物 72 只SD 雄性大鼠,體質(zhì)量200~220 g,購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2015-030,動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(川)2014-189。實(shí)驗(yàn)通過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào)2019284A,其間盡量減少動(dòng)物痛苦。
1.2 儀器 RM2016 切片機(jī)購自德國徠卡公司;BMJ-III 型包埋機(jī)、TSJ-II 全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、PHY-III 型病理組織漂烘儀均購自常州中威電子儀器廠;AE31 倒置顯微鏡購自廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司;JY200C 電泳儀、JY-SCZ4+垂直電泳槽均購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。
1.3 試劑與藥物 加味益氣通玄方的成人單日用量為155 g 生藥,由80 g 黃芪(批號(hào)19080063)、12 g 當(dāng)歸(批號(hào)19110059)、12 g 川芎(批號(hào)19100192)、12 g 赤芍、10 g 地龍(批號(hào)19070217)、10 g 桃仁(批號(hào)18110108)、10 g 紅花(批號(hào)19090095)、6 g 水蛭(批號(hào)18050159)、3 g 全蝎(批號(hào)17050133)組成,上述藥材購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司,西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑室制備中藥湯劑濃縮液。氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)購自美國Sigma-Aldrich 公司(貨號(hào)T8877,批號(hào)BCBX0337);原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購自瑞士 Roche 公司(貨號(hào) 11772465001,批號(hào)37412800);裂解液購自上海雅酶生物科技有限公司(貨號(hào)PC101,批號(hào)012B1050);BCA 蛋白定量試劑盒(貨號(hào)23227,批號(hào)TG268825)、ECL 顯影試劑盒(貨號(hào)32109,批號(hào)TF269 477 A)購自美國 Thermo 公司;抗 Akt(ab8805 )、p-Akt(ab38449 )、eNOS(ab76198 )、p-eNOS(ab184154)、Bcl-2(ab32124)、Bax(ab32503)、cleaved-Caspase3(ab32042)、β-actin(ab5694)的一抗,以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(ab205718)購自英國Abcam 公司。
2.1 分組、造模及給藥 72 只大鼠經(jīng)1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,阿司匹林組及加味益氣通玄方高、中、低劑量組,每組12 只。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注模型[5],方法為術(shù)前禁食12 h、禁水4 h,4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,沿頸部正中線縱向切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA),分別結(jié)扎CCA 近心端、ECA 和ICA 近分叉出打活結(jié),在CCA 近分叉處剪一倒“V”型切口,插入線栓,于插入線栓處用備用線結(jié)扎(以不出血為度),松開ICA 處活結(jié),緩慢推送線栓和栓線,線栓進(jìn)入ICA 后調(diào)整線栓頭端向內(nèi)向上,有阻力時(shí)停止推進(jìn),此時(shí)線栓頭端正好處于大腦中動(dòng)脈(MCA)起始部,造成阻斷,缺血2 h后輕柔拔出線栓;假手術(shù)組僅進(jìn)行頸部血管分離,不插入線栓,造模完成2 h 后大鼠出現(xiàn)對(duì)側(cè)偏癱,可認(rèn)為造模成功。造模24 h 后,阿司匹林組以60 mg/kg 劑量灌胃給藥,每天1 d,連續(xù)14 d;加味益氣通玄方成人單日用量為155 g,而大鼠和人用藥劑量的折算系數(shù)為6.25,假設(shè)人體質(zhì)量為70 kg,故大鼠正常劑量為13.84 g/kg,作為中劑量組,高、低劑量組分別為中劑量組的2、0.5 倍,即27.68、6.92 g/kg,分別灌胃給藥,每天1 次,連續(xù)14 d;假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水,每天1 次,連續(xù)14 d。
2.2 神經(jīng)缺損評(píng)分檢測(cè) 于給藥后第3、7、14 天,除假手術(shù)組外各組隨機(jī)選取8 只大鼠,根據(jù)Chen 等[6]報(bào)道的修正版神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity scores,mNSS)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià),主要內(nèi)容包括運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)(提尾實(shí)驗(yàn)0~3 分、行走實(shí)驗(yàn)0~3 分)、感覺實(shí)驗(yàn)(放置實(shí)驗(yàn)1 分、本體感覺實(shí)驗(yàn)1 分、平衡實(shí)驗(yàn)0~6分)、反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)(耳廓反射1 分、角膜反射1 分、驚恐反射1 分)及癲癇、肌陣攣、肌張力障礙(各1 分),總分18 分,分?jǐn)?shù)越高,神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。
2.3 腦梗死體積比例檢測(cè) 第7 天,各組隨機(jī)取3 只大鼠麻醉取腦,額葉切片2 mm,2%TTC 染色15 min,缺血性梗塞區(qū)域被染成白色,非缺血性梗塞區(qū)域被染成紅色,拍攝圖像,通過Image J 軟件計(jì)算腦梗死面積、腦組織總面積(腦梗死面積=對(duì)側(cè)半球面積-梗死側(cè)半球正常組織面積),兩者乘以切片厚度即為腦梗死體積、全腦體積,腦梗死體積比例=(腦梗死體積/全腦體積)×100%。
2.4 腦組織病理學(xué)觀察和凋亡測(cè)定 將大鼠腦組織制成石蠟組織切片(厚度4 μm),蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。再根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行腦組織凋亡檢測(cè),根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn) 收集大鼠梗塞區(qū)域的皮質(zhì)組織,裂解液充分裂解組織,提取總蛋白,BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度,進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳蛋白電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,5% 脫脂牛奶封閉1 h,并與Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3 蛋白的一抗在4 ℃下孵育過夜,將膜與耦聯(lián)有辣根過氧化物酶的二抗孵育,ECL 使條帶可視化。以β-actin 為內(nèi)參,對(duì)結(jié)果進(jìn)行均一化處理。
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以()表示,組間兩兩比較采用單因素方差分析(ANOVA),多重比較采用最小顯著性差異法(LSD)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 第3 天,與模型組比較,阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分均降低(P<0.01),加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組均高于加味益氣通玄方高劑量組(P<0.01)。第7 天,各給藥組神經(jīng)功能評(píng)分均低于模型組(P<0.01),加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方中劑量組、高劑量組(P<0.01)。第14 天,各給藥組神經(jīng)功能評(píng)分均低于模型組(P<0.01),加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方高劑量組(P<0.01)。各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。見表1。
表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(分,, n=8)Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups(score,, n=8)
表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(分,, n=8)Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups(score,, n=8)
注:與模型組比較,??P<0. 01;與加味益氣通玄方高劑量組比較,$$P<0. 01;與加味益氣通玄方中劑量組比較,&&P<0.01。
3.2 大鼠腦組織相對(duì)梗死體積 正常大鼠腦組織呈紅色,TTC 染色后變?yōu)榘咨?。與模型組比較,阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組、加味益氣通玄方中劑量組大鼠相對(duì)梗死體積降低(P<0.05,P<0.01);與加味益氣通玄方高劑量組比較,加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組大鼠相對(duì)梗死體積升高(P<0.01)。見圖1。
圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色及相對(duì)梗死體積Fig.1 TTC staining and relative infarct volumes of brain tissue in rats in various groups
3.3 大鼠腦組織病理損傷 假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞胞核形態(tài)和數(shù)量正常,核大而圓,核仁清晰,胞質(zhì)染色均勻,部分胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體清晰,未見明顯壞死;模型組大鼠正常細(xì)胞數(shù)量減少,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不明顯,神經(jīng)纖維水腫變性,排列散亂,染色明顯變淺,細(xì)胞體積減小,周圍間隙增寬,細(xì)胞核固縮或溶解消失;加味益氣通玄方低劑量組、中劑量組大鼠可見部分神經(jīng)元變性或壞死;加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組大鼠偶見神經(jīng)元變性或壞死;各給藥組大鼠細(xì)胞與模型組比較,均排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰。見圖2。
圖2 各組大鼠腦組織病理損傷Fig.2 Pathological injury of brain tissue in rats in various groups
3.4 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠TUNEL 染色呈陽性的細(xì)胞數(shù)量上升,腦組織細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.01),并呈劑量依賴性。見圖3。
圖3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡Fig.3 Cell apoptosis of brain tissue in rats in various groups
3.5 大鼠PI3K/Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) PI3K/Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白Akt、eNOS 各組間比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組p-Akt/Akt、peNOS/eNOS 比值降低(P<0.01);與模型組比較,加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS 比值升高(P<0.05,P<0.01),而加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組無明顯變化(P>0.05)。見圖4。
此外,與假手術(shù)組比較,模型組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低(P<0.01),促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3 表達(dá)及Bax/Bcl-2 比值升高(P<0.01);與模型組比較,阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組Bcl-2 表達(dá)升高(P<0.01),Bax、cleaved-Caspase3 表達(dá)量及Bax/Bcl-2 比值降低(P<0.01);加味益氣通玄方中劑量組Bcl-2 表達(dá)升高(P<0.01),Bax/Bcl-2 比值下降(P<0.01),Bax 表達(dá)量有下降趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),cleaved-Caspase3 表達(dá)降低(P<0.05);加味益氣通玄方低劑量組Bax/Bcl-2 比值降低(P<0.05)。
圖4 各組大鼠PI3K/Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of PI3K/Akt-eNOS pathwayrelated proteinsandapoptosis-related proteins in rats in various groups
本研究基于中醫(yī)玄府理論,結(jié)合目前中醫(yī)對(duì)中風(fēng)病的研究現(xiàn)狀,并依據(jù)古今醫(yī)家相關(guān)論述及現(xiàn)代研究,總結(jié)該病以“虛、風(fēng)、火、痰、瘀、毒”等為基本病機(jī),確定玄府郁閉貫穿中風(fēng)發(fā)病的整個(gè)階段,以古方補(bǔ)陽還五湯為基礎(chǔ),用黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、水蛭、全蝎九味中藥組成加味益氣通玄方。結(jié)果顯示,該方能有效緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,降低腦梗塞體積,改善皮質(zhì)區(qū)域病理變化,表明它能保護(hù)腦組織免受缺血再灌注損傷。
大量研究表明,細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注損傷有關(guān)[7-9]??沟蛲龅鞍譈cl-2、促凋亡蛋白Bax 定位于線粒體,響應(yīng)凋亡刺激,Bax 從細(xì)胞質(zhì)中的Bcl-2/Bax 異二聚體解離后Bax 易位到線粒體,刺激細(xì)胞色素C 釋放,并進(jìn)一步激活了半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),使Caspase3 裂解成活化的cleaved-Caspase3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10-11],并且Bcl-2 與Bax 之間的動(dòng)態(tài)平衡在腦缺血時(shí)的細(xì)胞命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用[12]。已有研究表明,腦缺血再灌注損傷可通過降低Bcl-2 表達(dá)、提高Bax 表達(dá)來加速生理性細(xì)胞凋亡[13-14],本實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果,表明加味益氣通玄方可以通過提高Bcl-2 表達(dá),降低Bax、cleaved-Caspase3 表達(dá)及Bax/Bcl-2 比值來保護(hù)腦組織。
eNOS 可通過抑制促凋亡蛋白來發(fā)揮促增殖作用[15-18],它產(chǎn)生的NO 對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用,而作為其活性和缺血性損傷結(jié)果的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,磷酸化eNOS 常用于評(píng)估腦血管功能[19],并且還能調(diào)控體內(nèi)腦血流量,改善慢性腦灌注不足引起的認(rèn)知障礙[20]。eNOS 活性受多種機(jī)制調(diào)控,其中經(jīng)典信號(hào)通路PI3K/Akt 是調(diào)控其活化的關(guān)鍵途徑之一,故阻斷PI3K/Akt 可抑制其活性[21]。前期報(bào)道,與假手術(shù)大鼠比較,腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中PI3K/Akt-eNOS 活性降低[8,22];本研究也發(fā)現(xiàn),缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中p-Akt、p-eNOS 表達(dá)低于假手術(shù)組,而加味益氣通玄方干預(yù)后被重新激活。
綜上所述,加味益氣通玄方可緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,降低腦梗塞體積,改善皮質(zhì)區(qū)域病理變化,減失皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是降低了Bax/Bcl-2 比值,激活PI3K/AkteNOS 通路。