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        加味益氣通玄方對大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用

        2021-03-07 07:04:40馮文戰(zhàn)
        中成藥 2021年1期
        關(guān)鍵詞:益氣腦缺血腦組織

        彭 艷,白 雪,馮文戰(zhàn),劉 祎,郭 佳,高 立

        (1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,四川瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科,四川瀘州 646000)

        缺血性卒中是由各種原因?qū)е戮植磕X組織血液供應(yīng)障礙,造成神經(jīng)元損傷、神經(jīng)功能缺損。緩解由腦缺血引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要方法是迅速恢復(fù)缺血區(qū)域的血流[1],但血液再灌注會增加興奮性氨基酸、氧自由基、細胞內(nèi)Ca2+產(chǎn)生,均可對腦組織造成額外的損傷,即腦缺血再灌注損傷,其發(fā)生發(fā)展涉及多個信號通路的變化。其中,磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydrxy kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)信號通路廣泛參與調(diào)節(jié)細胞活化,炎癥反應(yīng)、細胞凋亡,在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用[2-3]。

        研究表明,中藥及其單體可通過多種途徑作用于多個靶點,從而防治腦缺血再灌注損傷[4]。本實驗基于古方補陽還五湯,重用黃芪及具有辛味、開通玄府的藥物(如水蛭、全蝎)組成加味益氣通玄方,并基于PI3K/Akt-eNOS 信號通路探討該方對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用,以期為臨床用藥提供依據(jù)。

        1 材料

        1.1 動物 72 只SD 雄性大鼠,體質(zhì)量200~220 g,購自成都達碩實驗動物有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030,動物使用許可證號SYXK(川)2014-189。實驗通過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準,批號2019284A,其間盡量減少動物痛苦。

        1.2 儀器 RM2016 切片機購自德國徠卡公司;BMJ-III 型包埋機、TSJ-II 全自動封閉式組織脫水機、PHY-III 型病理組織漂烘儀均購自常州中威電子儀器廠;AE31 倒置顯微鏡購自廈門麥克奧迪實業(yè)有限公司;JY200C 電泳儀、JY-SCZ4+垂直電泳槽均購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

        1.3 試劑與藥物 加味益氣通玄方的成人單日用量為155 g 生藥,由80 g 黃芪(批號19080063)、12 g 當歸(批號19110059)、12 g 川芎(批號19100192)、12 g 赤芍、10 g 地龍(批號19070217)、10 g 桃仁(批號18110108)、10 g 紅花(批號19090095)、6 g 水蛭(批號18050159)、3 g 全蝎(批號17050133)組成,上述藥材購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司,西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑室制備中藥湯劑濃縮液。氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)購自美國Sigma-Aldrich 公司(貨號T8877,批號BCBX0337);原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自瑞士 Roche 公司(貨號 11772465001,批號37412800);裂解液購自上海雅酶生物科技有限公司(貨號PC101,批號012B1050);BCA 蛋白定量試劑盒(貨號23227,批號TG268825)、ECL 顯影試劑盒(貨號32109,批號TF269 477 A)購自美國 Thermo 公司;抗 Akt(ab8805 )、p-Akt(ab38449 )、eNOS(ab76198 )、p-eNOS(ab184154)、Bcl-2(ab32124)、Bax(ab32503)、cleaved-Caspase3(ab32042)、β-actin(ab5694)的一抗,以及辣根過氧化物酶標記的二抗(ab205718)購自英國Abcam 公司。

        2 方法

        2.1 分組、造模及給藥 72 只大鼠經(jīng)1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機分為假手術(shù)組,模型組,阿司匹林組及加味益氣通玄方高、中、低劑量組,每組12 只。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注模型[5],方法為術(shù)前禁食12 h、禁水4 h,4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,沿頸部正中線縱向切口,分離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA),分別結(jié)扎CCA 近心端、ECA 和ICA 近分叉出打活結(jié),在CCA 近分叉處剪一倒“V”型切口,插入線栓,于插入線栓處用備用線結(jié)扎(以不出血為度),松開ICA 處活結(jié),緩慢推送線栓和栓線,線栓進入ICA 后調(diào)整線栓頭端向內(nèi)向上,有阻力時停止推進,此時線栓頭端正好處于大腦中動脈(MCA)起始部,造成阻斷,缺血2 h后輕柔拔出線栓;假手術(shù)組僅進行頸部血管分離,不插入線栓,造模完成2 h 后大鼠出現(xiàn)對側(cè)偏癱,可認為造模成功。造模24 h 后,阿司匹林組以60 mg/kg 劑量灌胃給藥,每天1 d,連續(xù)14 d;加味益氣通玄方成人單日用量為155 g,而大鼠和人用藥劑量的折算系數(shù)為6.25,假設(shè)人體質(zhì)量為70 kg,故大鼠正常劑量為13.84 g/kg,作為中劑量組,高、低劑量組分別為中劑量組的2、0.5 倍,即27.68、6.92 g/kg,分別灌胃給藥,每天1 次,連續(xù)14 d;假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水,每天1 次,連續(xù)14 d。

        2.2 神經(jīng)缺損評分檢測 于給藥后第3、7、14 天,除假手術(shù)組外各組隨機選取8 只大鼠,根據(jù)Chen 等[6]報道的修正版神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity scores,mNSS)進行神經(jīng)功能評價,主要內(nèi)容包括運動實驗(提尾實驗0~3 分、行走實驗0~3 分)、感覺實驗(放置實驗1 分、本體感覺實驗1 分、平衡實驗0~6分)、反射喪失和不正常運動(耳廓反射1 分、角膜反射1 分、驚恐反射1 分)及癲癇、肌陣攣、肌張力障礙(各1 分),總分18 分,分數(shù)越高,神經(jīng)功能缺損越嚴重。

        2.3 腦梗死體積比例檢測 第7 天,各組隨機取3 只大鼠麻醉取腦,額葉切片2 mm,2%TTC 染色15 min,缺血性梗塞區(qū)域被染成白色,非缺血性梗塞區(qū)域被染成紅色,拍攝圖像,通過Image J 軟件計算腦梗死面積、腦組織總面積(腦梗死面積=對側(cè)半球面積-梗死側(cè)半球正常組織面積),兩者乘以切片厚度即為腦梗死體積、全腦體積,腦梗死體積比例=(腦梗死體積/全腦體積)×100%。

        2.4 腦組織病理學(xué)觀察和凋亡測定 將大鼠腦組織制成石蠟組織切片(厚度4 μm),蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。再根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書進行腦組織凋亡檢測,根據(jù)陽性細胞數(shù)量計算細胞凋亡率。

        2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)實驗 收集大鼠梗塞區(qū)域的皮質(zhì)組織,裂解液充分裂解組織,提取總蛋白,BCA 蛋白測定試劑盒測定濃度,進行聚丙烯酰氨凝膠電泳蛋白電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,5% 脫脂牛奶封閉1 h,并與Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3 蛋白的一抗在4 ℃下孵育過夜,將膜與耦聯(lián)有辣根過氧化物酶的二抗孵育,ECL 使條帶可視化。以β-actin 為內(nèi)參,對結(jié)果進行均一化處理。

        2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理,數(shù)據(jù)以()表示,組間兩兩比較采用單因素方差分析(ANOVA),多重比較采用最小顯著性差異法(LSD)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 大鼠神經(jīng)功能評分 第3 天,與模型組比較,阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組神經(jīng)功能評分均降低(P<0.01),加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組均高于加味益氣通玄方高劑量組(P<0.01)。第7 天,各給藥組神經(jīng)功能評分均低于模型組(P<0.01),加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方中劑量組、高劑量組(P<0.01)。第14 天,各給藥組神經(jīng)功能評分均低于模型組(P<0.01),加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方高劑量組(P<0.01)。各組大鼠神經(jīng)功能評分均隨時間延長均呈下降趨勢。見表1。

        表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分(分,, n=8)Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups(score,, n=8)

        表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分(分,, n=8)Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups(score,, n=8)

        注:與模型組比較,??P<0. 01;與加味益氣通玄方高劑量組比較,$$P<0. 01;與加味益氣通玄方中劑量組比較,&&P<0.01。

        3.2 大鼠腦組織相對梗死體積 正常大鼠腦組織呈紅色,TTC 染色后變?yōu)榘咨?。與模型組比較,阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組、加味益氣通玄方中劑量組大鼠相對梗死體積降低(P<0.05,P<0.01);與加味益氣通玄方高劑量組比較,加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組大鼠相對梗死體積升高(P<0.01)。見圖1。

        圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色及相對梗死體積Fig.1 TTC staining and relative infarct volumes of brain tissue in rats in various groups

        3.3 大鼠腦組織病理損傷 假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞胞核形態(tài)和數(shù)量正常,核大而圓,核仁清晰,胞質(zhì)染色均勻,部分胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體清晰,未見明顯壞死;模型組大鼠正常細胞數(shù)量減少,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不明顯,神經(jīng)纖維水腫變性,排列散亂,染色明顯變淺,細胞體積減小,周圍間隙增寬,細胞核固縮或溶解消失;加味益氣通玄方低劑量組、中劑量組大鼠可見部分神經(jīng)元變性或壞死;加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組大鼠偶見神經(jīng)元變性或壞死;各給藥組大鼠細胞與模型組比較,均排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰。見圖2。

        圖2 各組大鼠腦組織病理損傷Fig.2 Pathological injury of brain tissue in rats in various groups

        3.4 大鼠腦組織細胞凋亡 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠TUNEL 染色呈陽性的細胞數(shù)量上升,腦組織細胞凋亡率增加(P<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織細胞凋亡率均降低(P<0.01),并呈劑量依賴性。見圖3。

        圖3 各組大鼠腦組織細胞凋亡Fig.3 Cell apoptosis of brain tissue in rats in various groups

        3.5 大鼠PI3K/Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達 PI3K/Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白Akt、eNOS 各組間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組p-Akt/Akt、peNOS/eNOS 比值降低(P<0.01);與模型組比較,加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS 比值升高(P<0.05,P<0.01),而加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組無明顯變化(P>0.05)。見圖4。

        此外,與假手術(shù)組比較,模型組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低(P<0.01),促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3 表達及Bax/Bcl-2 比值升高(P<0.01);與模型組比較,阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組Bcl-2 表達升高(P<0.01),Bax、cleaved-Caspase3 表達量及Bax/Bcl-2 比值降低(P<0.01);加味益氣通玄方中劑量組Bcl-2 表達升高(P<0.01),Bax/Bcl-2 比值下降(P<0.01),Bax 表達量有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),cleaved-Caspase3 表達降低(P<0.05);加味益氣通玄方低劑量組Bax/Bcl-2 比值降低(P<0.05)。

        圖4 各組大鼠PI3K/Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.4 Expressions of PI3K/Akt-eNOS pathwayrelated proteinsandapoptosis-related proteins in rats in various groups

        4 討論

        本研究基于中醫(yī)玄府理論,結(jié)合目前中醫(yī)對中風(fēng)病的研究現(xiàn)狀,并依據(jù)古今醫(yī)家相關(guān)論述及現(xiàn)代研究,總結(jié)該病以“虛、風(fēng)、火、痰、瘀、毒”等為基本病機,確定玄府郁閉貫穿中風(fēng)發(fā)病的整個階段,以古方補陽還五湯為基礎(chǔ),用黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、水蛭、全蝎九味中藥組成加味益氣通玄方。結(jié)果顯示,該方能有效緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,降低腦梗塞體積,改善皮質(zhì)區(qū)域病理變化,表明它能保護腦組織免受缺血再灌注損傷。

        大量研究表明,細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷有關(guān)[7-9]??沟蛲龅鞍譈cl-2、促凋亡蛋白Bax 定位于線粒體,響應(yīng)凋亡刺激,Bax 從細胞質(zhì)中的Bcl-2/Bax 異二聚體解離后Bax 易位到線粒體,刺激細胞色素C 釋放,并進一步激活了半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng),使Caspase3 裂解成活化的cleaved-Caspase3,最終導(dǎo)致細胞凋亡[10-11],并且Bcl-2 與Bax 之間的動態(tài)平衡在腦缺血時的細胞命運中起著關(guān)鍵作用[12]。已有研究表明,腦缺血再灌注損傷可通過降低Bcl-2 表達、提高Bax 表達來加速生理性細胞凋亡[13-14],本實驗也得到相似結(jié)果,表明加味益氣通玄方可以通過提高Bcl-2 表達,降低Bax、cleaved-Caspase3 表達及Bax/Bcl-2 比值來保護腦組織。

        eNOS 可通過抑制促凋亡蛋白來發(fā)揮促增殖作用[15-18],它產(chǎn)生的NO 對腦缺血再灌注損傷起到保護作用,而作為其活性和缺血性損傷結(jié)果的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,磷酸化eNOS 常用于評估腦血管功能[19],并且還能調(diào)控體內(nèi)腦血流量,改善慢性腦灌注不足引起的認知障礙[20]。eNOS 活性受多種機制調(diào)控,其中經(jīng)典信號通路PI3K/Akt 是調(diào)控其活化的關(guān)鍵途徑之一,故阻斷PI3K/Akt 可抑制其活性[21]。前期報道,與假手術(shù)大鼠比較,腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中PI3K/Akt-eNOS 活性降低[8,22];本研究也發(fā)現(xiàn),缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中p-Akt、p-eNOS 表達低于假手術(shù)組,而加味益氣通玄方干預(yù)后被重新激活。

        綜上所述,加味益氣通玄方可緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,降低腦梗塞體積,改善皮質(zhì)區(qū)域病理變化,減失皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡,其機制可能是降低了Bax/Bcl-2 比值,激活PI3K/AkteNOS 通路。

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