趙 麗 肖 婷張建強武道圓劉 學(xué)周 威吳林菁沈祥春茅向軍陶 玲?

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省天然藥物資源高效利用工程中心，貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室，貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽市聯(lián)合重點實驗室，天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽 550004；3.貴州恒霸藥業(yè)有限責(zé)任公司，貴陽國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)金陽知識產(chǎn)業(yè)園，貴州貴陽 550008；4.貴州省藥品監(jiān)督管理局檢查中心，貴州貴陽 550081）

痹痛寧膠囊由馬錢子粉、全蝎、僵蠶、麻黃、蒼術(shù)、乳香、沒藥、川牛膝、刺五加浸膏、甘草10 味藥材組成，適用于寒濕陰絡(luò)所致的痹病癥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用［1-4］，方中馬錢子粉主要成分為士的寧、馬錢子堿，具有毒性，而鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿也屬于毒性、麻醉類成分。因此，建立痹痛寧膠囊中上述4 種生物堿含量的測定方法，并控制其范圍，對保證臨床療效和用藥安全具有重要意義。

痹痛寧膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ［WS3-228（2-032）-20012-2］僅對士的寧含量進(jìn)行了測定，難以全面反映該制劑中士的寧、馬錢子堿、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的特征，而且關(guān)于其多成分定量分析的報道也較少［5-8］，大多采用HPLC 法，前處理方法也較復(fù)雜［9-11］；GC-MS 法分析時間較長，并采用SIM 模式掃描，定量也不如MRM 模式精準(zhǔn)［12］。因此，本實驗建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）法同時測定痹痛寧膠囊中上述4 種生物堿的含量，該方法靈敏度高，專屬性好，分析周期短，提取方式簡便，可為建立該制劑更全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

1 材料

XEVO-TQ 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XP26 型痕量分析天平、XS105DU 型電子分析天平（0.001 mg）［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；100～1 000 μL移液器（德國Eppendorf 公司）；D24UV 型純水儀（美國Millipore 公司）。

士的寧（批號10705-200306，純度97%）、馬錢子堿（批號110706-200505，純度95.7%）、鹽酸麻黃堿（批號171241-201508，純度99.8%）、鹽酸偽麻黃堿（批號 171237-201208，純度99.9%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。痹痛寧膠囊（貴州恒霸藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號20181001、20181201、20181202、20190103、20190201、20190202、20190401、20190402、20190403、20190501、20 190502；黑龍江烏蘇里江制藥有限公司，批號20190501、20190502、20190506、20190507、20190508）。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取士的寧、馬錢子堿、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品4.178、3.300、3.714、3.852 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.417 8、0.330 0、0.371 4、0.385 2 mg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 取膠囊10 粒，傾出內(nèi)容物后研細(xì)，混勻，精密稱取0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水-濃鹽酸（50∶50∶1）混合溶液20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W、40 kHz）處理15 min，放冷，混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 UPLC-MS／MS 條件

2.2.1 色譜 ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相水（含0.1%甲酸）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～6 min，4.0% A；6～7 min，4.0%～18.0% A；7～9 min，18.0%～55.0% A；9～10 min，55.0%～100.0% A；10～12 min，100.0% A；12～13 min，100.0%～4.0% A，13～15 min，4.0% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量0.3 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度500 ℃，體積流量1 000 L／h；錐孔氣體積流量50 L／h；碰撞氣體積流量0.15 mL／min；毛細(xì)管電壓0.3 kV。其他參數(shù)見表1，總離子流色譜圖、MRM 色譜圖分別見圖1～2。

表1 各成分MS 參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取馬錢子堿對照品溶液0.2 mL、士的寧對照品溶液0.25 mL，置于同一20 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密吸取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品溶液各0.5 mL，置于同一200 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取前2 種溶液0.1、0.4、0.7、1.0、1.3 mL，后2 種溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，置于5 個10 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度溶液（士的寧0.050 66、0.202 6、0.354 6、0.506 6、0.658 6 mg／L，馬錢子堿0.031 58、0.126 3、0.221 1、0.315 8、0.410 6 mg／L，鹽酸麻黃堿0.009 266、0.018 53、0.037 07、0.074 13、0.148 3 mg／L，鹽酸偽麻黃堿0.009 620、0.019 24、0.038 48、0.076 96、0.153 9 mg／L），在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，并分別以S／N ＝3、S／N ＝10 為檢測限、定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 各成分MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of vrious constituents

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.3.1”項下對照品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定8 次，測得士的寧、馬錢子堿、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD 分別為0.4%、0.5%、0.5%、0.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批膠囊（批號20181001），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，測得士的寧、馬錢子堿、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD 分別為1.5%、1.2%、1.9%、1.6%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批膠囊（批號20181001），按“2.1.2”項下方法平行制備8 份供試品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，測得士的寧、馬錢子堿、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量RSD 分別為1.2%、1.0%、1.1%、0.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取含量已知的膠囊（批號20181001）約0.1 g，精密稱定，共9 份，加入高、中、低質(zhì)量濃度對照品溶液，每個質(zhì)量濃度3 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測定 精密稱取各批膠囊，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

3 討論

3.1 流動相篩選 本實驗考察了乙腈-水、乙腈-水（含-0.1%甲酸）等流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（含-0.1%甲酸）洗脫時各成分均顯示較高的檢測靈敏度和較好的峰形。另外，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿為同分異構(gòu)體，可產(chǎn)生相同的二級碎片離子，故調(diào)整乙腈-水（含-0.1% 甲酸）比例為4∶96，兩者分離度可達(dá)到要求。

3.2 提取方法篩選 本實驗考察了三氯甲烷（加2 mL 氫氧化鈉溶液）加熱回流2 h、甲醇-水-濃鹽酸超聲30 min［13］、50%甲醇（加2 mL 氫氧化鈉溶液）加熱回流2 h［14］、50%甲醇（加2 mL 氫氧化鈉溶液）超聲30 min、甲醇超聲30 min，1.44%磷酸超聲30 min［15］，發(fā)現(xiàn)甲醇-水-濃鹽酸超聲30 min時，各成分提取都較為完全，而且更快速簡便，毒性較低。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察甲醇-水、濃鹽酸比例，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取時各成分提取最完全，而在不同比例濃鹽酸（0.5、1、2）下其含量無顯著差異。最終確定，提取溶劑為甲醇-水-濃鹽酸（50∶50∶1）。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝3）

表4 各成分含量測定結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3.3 含量限度制定 士的寧、馬錢子堿均為毒性成分，而且前者有效劑量、中毒劑量比較接近［16-20］。2015 年版《中國藥典》 規(guī)定，馬錢子粉中士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)為0.78～0.82%，日用量為0.3～0.6 g，即相當(dāng)于2.4～4.8 mg，而痹痛寧膠囊日用量為0.8 g，故測得該成分高限值為6.0 mg／g。16 批樣品中士的寧、馬錢子堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.88、2.65 mg／g，據(jù)經(jīng)驗按80%計，兩者低限值分別為3.1、2.1 mg／g。因此，建議痹痛寧膠囊中士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為3.1～6.0 mg／g，而馬錢子堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于2.1 mg／g。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿是國家嚴(yán)格管制的毒性、麻醉類成分［21］，2015 年版《中國藥典》 規(guī)定，麻黃中兩者總量不得少于0.80%。痹痛寧膠囊中麻黃所占比例為6.1%，折算成鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿總量應(yīng)不得少于0.49 mg／g，故建議以其為這2 種成分含量的限度。