胡曉熠 王惠明

感染性疾病為臨床常見疾病，其防治重要性日益凸顯，而相關病原體常規(guī)檢測方法存在周期長，陽性率低等缺點，難以滿足臨床需求。下一代基因測序(Next Generation Sequencing，NGS)也稱高通量測序或大規(guī)模并行測序，是一種將數(shù)百萬甚至數(shù)億條DNA片段同時和獨立測序的技術，為感染性疾病的臨床防治提供了新的方法，也為公共衛(wèi)生事件調(diào)查和發(fā)現(xiàn)新的傳染病，以及開發(fā)疫苗及研究抗菌藥物等提供了技術支持。

NGS技術在臨床微生物的檢測應用包括全基因組測序、16rRNA基因測序和宏基因組二代測序(Metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS)等。mNGS是一種平行檢測樣本所有核酸(DNA和/或RNA)的方法，可以快速、高效、準確地獲得檢測樣本的基因組信息，從而分析出致病病原體，指導臨床診斷和治療，其潛力和優(yōu)勢已被越來越多的研究所證實[1,2]。本文綜述mNGS在細菌、真菌、病毒和寄生蟲等感染中的診斷優(yōu)勢和臨床應用進展。

1 NGS技術簡介

2005年Roche公司率先推出基于微乳液PCR技術的NGS技術，標志著NGS時代的到來[3]。隨后眾多科研機構和生物公司均相繼開展這一技術的研究工作，目前常見的有Roche公司的454測序、Illumina公司的Solexa測序以及ABI公司的SOLID測序[4]。不論是基于乳液PCR技術還是橋式PCR技術的測序方法，本質都是將目標DNA或RNA片段先碎片化，通過對小片段核酸的擴增和精準測序，并與已知參考基因片段進行對比、定位和整合分析，進而通過計算機算法獲得目標核酸的完整序列[5]。

2 mNGS檢測的臨床應用

近年來，許多新發(fā)感染不斷出現(xiàn)，埃博拉病毒及新型冠狀病毒的傳播，疑難感染病例的增多，耐多藥病原體(產(chǎn)碳青霉烯酶的革蘭氏陰性菌)的產(chǎn)生等[6]，傳統(tǒng)的檢測方法如培養(yǎng)、核酸擴增試驗等已很難滿足臨床需求。mNGS幾乎可以檢測所有類型的感染性病原體,包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲、支原體、鉤端螺旋體等，甚至可以檢測到新的微生物，可以更加低成本、準確、快速、全面地診斷病原體的宏基因組[1,7,8]。mNGS對病原菌鑒定具有較高的敏感性，且受抗生素使用的影響較小，是一種有前景的感染性病原體檢測技術。

2.1 mNGS在細菌性感染中的應用

細菌是感染性疾病最常見的病原體之一。培養(yǎng)法是細菌分離的標準方法，但細菌培養(yǎng)時間長，且很多細菌難以培養(yǎng)，陽性率較低，多重感染易被忽略，以及標本易被污染能致假陽性等，給臨床工作帶來困擾，更不能滿足急危重癥感染性疾病的診治需求[9]。采用mNGS可以避開傳統(tǒng)檢測方法的局限，迅速鑒定樣本中的已知病原體，有效發(fā)現(xiàn)未知的病原體，為臨床診療提供幫助。Wang等[10]對18例腦脊液標本的分析結果表明，mNGS與常規(guī)方法比較，可將結核性腦膜炎的結核分枝桿菌檢出率提高到95.65%，固而認為mNGS是一種檢測結核性腦膜炎患者腦脊液分枝桿菌的替代方法，值得作為腦脊液標本的一線檢測方法。Zhang等[11]在135名細菌性腦膜炎患者中，應用mNGS診斷肺炎鏈球菌腦膜炎的敏感性和特異性分別為73.1%和88.1%，陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)分別為59.4%和93.2%，并且采集標本前使用抗生素治療對檢測結果的影響小于培養(yǎng)法。此外，mNGS對重癥感染性疾病及不明原因發(fā)熱具有重要的診斷價值[12，13]。有研究報道了一例高熱男性患者，傳統(tǒng)培養(yǎng)和血清學檢測細菌均為陰性，而mNGS顯示患者尿液標本中存在糞腸球菌，Sanger測序和qPCR分析進一步證實，經(jīng)采用靶向抗生素治療后患者很快康復[14]。以上結果顯示mNGS作為一種新的不依賴培養(yǎng)的方法，顯示了快速、敏感和準確的病原體鑒定能力，并能為臨床醫(yī)生制定合適的治療方案提供依據(jù)。

2.2 mNGS在病毒性感染中的應用

目前病毒性疾病是以免疫學診斷為主，針對病毒DNA或RNA的檢測方法，PCR、基因芯片等分子診斷方法的應用也較為廣泛,但是這些方法都需要預判可能的病毒類型，無法診斷出未知的病毒性病原體。利用mNGS則無需預判病原體類型，也不存在靶向測序法中的偏依性[15]，甚至有可能發(fā)現(xiàn)新的病原體。如2014年剛果民主共和國爆發(fā)埃博拉出血熱，Li等[16]應用mNGS從70例疑似埃博拉出血熱患者的全血樣本中檢測到扎伊爾埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)和其它潛在的病原體，包括15例惡性瘧原蟲感染和9例獨立感染，以及乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)、人佩吉病毒(Human Pegivirus 1，HPgV-1)、奧倫戈病毒(Orungo Virus)等，表明mNGS在廣泛的病原體檢測和疫情監(jiān)測中有特別的作用。另外，mNGS對病毒檢出率也高于傳統(tǒng)檢測方法。Jerome等[17]使用mNGS在40例罹患急性發(fā)熱性疾病的英國旅客中檢測出11例病毒感染，而傳統(tǒng)方法僅有5例，mNGS檢測出包括登革熱病毒(Dengue Virus)、戊型肝炎病毒(HEV)、埃博拉病毒(Ebola Virus)、甲型肝炎(HAV)病毒、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus)和腮腺炎病毒(Mumps Virus)等，研究結果顯示mNGS提高了對病毒感染診斷的敏感性，可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)診斷方法漏診的病例。

mNGS對新型冠狀病毒的檢出也有重要貢獻。2019年12月武漢爆發(fā)了不明原因肺炎，Chen等[18]對2名與華南海鮮市場有獨立接觸史后并出現(xiàn)急性呼吸綜合征患者提取其支氣管肺泡灌洗液(BALF)RNA，用mNGS快速鑒定出一種新型冠狀病毒(2019-nCoV)，并且根據(jù)基因分析，認為2019-nCoV很可能是一種獨立從動物傳染人類的新型冠狀病毒。說明mNGS分析可獲得無偏倚性的潛在病原體，在診斷不明原因肺炎中有重要作用[19]。與目前的微生物診斷技術相比，mNGS對病毒病原體診斷具有更全面的檢測能力，尤其可以檢測出未知病原體，發(fā)現(xiàn)新發(fā)傳染病，幫助公共衛(wèi)生機構更快更好地了解和應對病毒爆發(fā)流行[20]。

2.3 mNGS在真菌性感染中的應用

隨著抗腫瘤藥物等免疫抑制劑以及廣譜抗菌藥使用的增加，臨床上合并真菌感染的病例在逐漸增多，特別是免疫力低下或者長期處于免疫抑制狀態(tài)人群，比如HIV感染或者腫瘤患者。Zinter等[21]收集了41份免疫缺陷兒童的下呼吸道標本，通過mNGS分析，發(fā)現(xiàn)每個標本中都有大量的細菌、真菌、RNA病毒和DNA病毒，而傳統(tǒng)方法診斷為陰性的樣本中，有一半檢測到了潛在病原體，其中34.1%的樣品中檢測到曲霉菌RNA，提示免疫缺陷兒童的肺部經(jīng)常暴露于低水平曲霉菌中。Alonso等[22]在肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)患者的冷凍神經(jīng)組織中提取DNA進行mNGS分析，鑒定出多種真菌屬，包括念珠菌、馬拉色菌、鐮刀菌、葡萄孢菌、木霉菌和隱球菌，證實肌萎縮性脊髓側索硬化癥患者存在混合真菌感染。Zhang等[23]報道2例肋骨軟組織腫塊患者，最初被認為是軟組織腫瘤，真菌培養(yǎng)為陰性，后來進行mNGS發(fā)現(xiàn)有隱球菌感染，經(jīng)口服氟康唑治療后，癥狀好轉。臨床上傳統(tǒng)的真菌檢測主要依靠常規(guī)鏡檢或者傳統(tǒng)培養(yǎng)法，檢測過程繁瑣，培養(yǎng)周期過長，常常會延誤診斷或者漏診，導致感染加重，mNGS具有快速和敏感的特點，特別對常規(guī)方法難以檢測出合并真菌感染的病例更有優(yōu)勢。

2.4 mNGS在寄生蟲及其它感染中的應用

目前，寄生蟲感染的確診主要依靠患者的體液、分泌物、排泄物的鏡檢或臨床免疫學檢查，但是這些方法都對樣本類型、收集時間等有嚴格要求，檢驗者的經(jīng)驗也對檢驗結果有較大影響。mNGS檢測可以彌補目前檢測方法的不足。Wilson等[24]對7例難診斷性亞急性或慢性腦膜炎患者的腦脊液進行mNGS分析的結果顯示，1例感染豬帶絳蟲，1例感染HIV-1，另外4例分別感染新生隱球菌、米曲菌、莢膜組織胞漿菌、杜氏假絲酵母菌，這是第一次使用mNGS檢測診斷出蛛網(wǎng)膜下腔神經(jīng)囊蟲病導致慢性腦膜炎的病例，固而認為mNGS是一種快速并且成本相對較低的方法，可以作為單一的診斷方法，無偏移地篩查腦脊液病原體。Hu等[25]用mNGS分析一例HIV感染患者的致死性腦損傷病原體，最后分析出感染病原體為弓形蟲，并指出mNGS可能為弓型原蟲腦炎診斷的有效方法。

支原體，鉤端螺旋體用常規(guī)檢測方法難以培養(yǎng)和鑒定，常常為陰性結果，但是mNGS可使不典型鉤端螺旋體病早期得以確診[26]。Wang等[27]對32例診斷為重癥肺炎兒童的BALF分別進行傳統(tǒng)方法和mNGS檢測，其中15例樣本用傳統(tǒng)方法沒有檢測出病原體，但是32例標本使用mNGS均檢測出包括肺炎支原體、腺病毒、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、巨細胞病毒和博卡病毒等病原體，表明使用mNGS可顯著提高重癥肺炎患兒病原菌檢測的敏感性。Thoendel等[28]同樣在培養(yǎng)陰性的假體關節(jié)感染標本中，通過mNGS檢測出唾液支原體。這些結果說明當無臨床表現(xiàn)，傳統(tǒng)檢驗方法無法確定病原體時，mNGS檢測可作為一種有效的補充方法。

3 mNGS在病原體檢測中的問題及局限性

mNGS應用于臨床檢測還面臨許多實際問題。(1)缺乏標準化的數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析；尚未建立統(tǒng)一的各類臨床標本NGS的前處理標準[29]。(2)mNGS缺乏有效性驗證，并且暫時還無法覆蓋藥敏結果，因此仍然需要結合傳統(tǒng)的檢測方法對疾病進行診斷[30]。(3)假陽性結果，mNGS可能由于污染而出現(xiàn)假陽性結果，包括環(huán)境中正常的人體菌落，采集樣本過程中、實驗室檢測試劑等，都可能成為污染源。對此，實驗室醫(yī)生可通過增加對實驗室試劑定期評估、設置陰性對照、嚴格遵守操作流程、盡可能保持無核酸環(huán)境等措施來減少假陽性結果出現(xiàn)[31]。(4)假陰性結果，大部分病原體RNA容易降解，運輸及保存過程中沒有嚴格執(zhí)行運輸標準可能是導致其降解的原因。(5)宏基因組學提供了大量的數(shù)據(jù)，需要專業(yè)的生物信息團隊進行大數(shù)據(jù)分析，并不斷改進技術和軟件的應用，使結果的成本和時間下降[32]。(6)目前大部分研究是以病原體的定性分析為主，有待進一步擴大數(shù)據(jù)庫規(guī)模，將定性信息轉變?yōu)槎啃畔?，增加臨床診斷結果的準確性[33]。

4 小 結

mNGS技術可以突破傳統(tǒng)檢測方法的局限性，對細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體獲得快速、廣泛、靈敏度高的診斷結果，針對難以培養(yǎng)的病原體及不明原因無法預判的感染性疾病患者，可利用mNGS技術得到覆蓋齊全、準確的病原體信息，為臨床治療特別是個體化用藥提供依據(jù)。盡管mNGS相比較于傳統(tǒng)檢測方法有許多優(yōu)勢，但是目前并不能完全取代傳統(tǒng)方法，兩種方法相結合可以提高臨床診斷率。今后要制定科學的mNGS檢測流程、臨床應用指南、加快數(shù)據(jù)庫建設、罕見病原體基因譜研究，擴展其潛在的應用領域，進一步提高靈敏度和特異度，進一步推進臨床微生物學和感染病學的發(fā)展，更好地服務于臨床，更多地使患者獲益。

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