劉美岑，劉蕾

解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110016

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要組織學(xué)亞型，占肺癌患者的85%。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是最常見(jiàn)的 NSCLC 亞型。其中，LUAD是NSCLC中最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，占NSCLC的50%以上。大約70%的肺癌患者被診斷時(shí)為晚期，此時(shí)患者已經(jīng)錯(cuò)過(guò)了接受手術(shù)、化療和放療的機(jī)會(huì)。中晚期就診、缺乏可靠的生物標(biāo)志物、不精準(zhǔn)的治療靶點(diǎn)已成為治療LUAD的主要障礙。因此，早期診斷和治療對(duì)于改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量至關(guān)重要。10型膠原α1鏈（collagen typeⅩ alpha 1 chain，COL10A1）基因編碼的產(chǎn)物是10型膠原蛋白的α1鏈，是一種主要的間質(zhì)基質(zhì)成分。它通過(guò)形成同源三聚體，組成10型膠原蛋白。COL10A1在許多實(shí)體腫瘤中表達(dá)升高，如結(jié)腸癌、食管癌和乳腺癌，并在關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成。分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）是一種分泌型磷酸化糖磷蛋白，人類

SPP1

基因位于第4號(hào)染色體（4q13）上，有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。該蛋白可由多種細(xì)胞分泌，如破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，涉及多種生物學(xué)功能。本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組和臨床數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析

COL10A1

、

SPP1

mRNA表達(dá)與LUAD診斷和預(yù)后的關(guān)系，預(yù)測(cè)COL10A1和SPP1參與LUAD發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，探討COL10A1和SPP1在LUAD診斷及預(yù)后中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料收集

從TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcga-data.nci.nih.gov/）下載

COL10A1

和

SPP1

基因mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)集及與之相一致的患者臨床資料。僅保留臨床資料和生存信息完整的病例，共納入LUAD患者594例。

1.2 表達(dá)差異分析

利用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索COL10A1和SPP1在正常肺組織和LUAD組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)行比較?；跀?shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析

COL10A1

和

SPP1

基因在正常肺組織和LUAD組織中的表達(dá)差異、在不同分期LUAD組織中的表達(dá)差異及其與LUAD預(yù)后的關(guān)系。

1.3 生存分析

為明確COL10A1和SPP1表達(dá)在LUAD預(yù)后中的價(jià)值，采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析，應(yīng)用“Auto select best cut off”方法[該方法計(jì)算基因高低表達(dá)四分位數(shù)之間所有可能的邊界值，并使用最佳性能閾值作為邊界值。結(jié)果中除了顯示

P

值外，還將顯示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）]比較數(shù)據(jù)庫(kù)中COL10A1和SPP1的表達(dá)水平對(duì)719例LUAD患者生存期的影響。

1.4 免疫組化分析

人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜（the Human Protein Atlas，HPA）是基于RNA測(cè)序分析和免疫組化分析的大型轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/），可用于正常組織和腫瘤組織中蛋白差異表達(dá)分析。通過(guò)該網(wǎng)站分析

SPP1

基因在不同分級(jí)的LUAD組織中的表達(dá)。通過(guò)SPP1組化抗體（HPA027541）對(duì)正常肺組織和肺癌組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，分析3例正常肺組織和3例肺癌組織中SPP1蛋白表達(dá)及抗體染色程度。

1.5 預(yù)后影響因素分析

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中較完整的325例LUAD患者數(shù)據(jù)信息，利用Cox回歸模型分析臨床特征、COL10A1和SPP1表達(dá)與LUAD預(yù)后的關(guān)系。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

為探討COL10A1和SPP1表達(dá)水平對(duì)相關(guān)生物通路基因集的影響，本研究分析與COL10A1和SPP1相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)以及這些相互作用蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)一步分析COL10A1和SPP1影響肺癌患者預(yù)后可能的作用機(jī)制，并通過(guò)GSEA分析不同表達(dá)水平的COL10A1和SPP1對(duì)多種生物通路基因集的影響。從分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)（molecular signatures database，MsigDB）中獲得參照（h.all.v7.4.symbols.gmt和 c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt）基因集，按default weight edenrichment statistic的方法，每個(gè)分析重復(fù)1000次。在GSEA中按

P

＜0.05且FDR＜0.25判斷顯著富集基因集。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）[

M

（

P

，

P

）]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析；以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中COL10A1和SPP1表達(dá)量的比較

針對(duì)535例LUAD組織和59例癌旁組織的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，LUAD組織中COL10A1和SPP1表達(dá)量均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。對(duì)57例患者的腫瘤組織與癌旁組織的分析結(jié)果表明，LUAD組織中COL10A1和SPP1表達(dá)量均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1、表2）

表1 535例LUAD組織和59例癌旁組織中COL10A1和SPP1表達(dá)量的比較[M，（P25，P75）]

表2 57例患者的LUAD組織和癌旁組織中COL10A1和SPP1表達(dá)量的比較[M，（P25，P75）]

2.2 不同COL10A1和SPP1表達(dá)情況的LUAD患者生存情況的比較

分析Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中的719例LUAD患者的生存情況，結(jié)果顯示，COL10A1和SPP1高表達(dá)LUAD患者的生存期均明顯長(zhǎng)于低表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[HR=0.51（0.40～0.66）、1.83（1.42～2.38），

P

＜0.01）]。（圖1、圖2）

圖1 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析中COL10A1高表達(dá)（n=290）與COL10A1低表達(dá)（n=429）LUAD患者的生存曲線

圖2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析中SPP1高表達(dá)（n=181）與SPP1低表達(dá)（n=538）LUAD患者的生存曲線

2.3 LUAD中SPP1特征的初步驗(yàn)證

為驗(yàn)證以上結(jié)果，本研究重點(diǎn)探討肺癌中SPP1蛋白表達(dá)情況。采用HPA公共數(shù)據(jù)庫(kù)中肺癌免疫組化標(biāo)本評(píng)估SPP1的表達(dá)情況，且引用該數(shù)據(jù)庫(kù)中SPP1（組化抗體編號(hào)HPA027541）的免疫組化檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，肺癌患者的SPP1特異性染色呈陽(yáng)性，與正常肺組織中SPP1蛋白表達(dá)存在顯著差異。與正常肺組織相比，SPP1在LUAD組織中呈高表達(dá)（圖3）。

圖3 SPP1蛋白在正常肺組織與LAUD組織中的表達(dá)差異（免疫組化染色，×100）

2.4 LUAD患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲取325例LUAD患者信息，將其臨床特征以R語(yǔ)言處理。將年齡、性別、腫瘤分期、TNM分期、COL10A1表達(dá)、SPP1表達(dá)進(jìn)行單因素分析及多因素分析，Cox多因素分析結(jié)果表明，腫瘤分期是LUAD患者預(yù)后的影響因素（

P

＜0.01）。（表3）

表3 預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析

2.5 COL10A1和SPP1的功能基因集富集

GSEA富集分析結(jié)果顯示，COL10A1高表達(dá)的樣本富集了與血管新生、頂端連結(jié)、凝結(jié)、DNA修復(fù)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、脂肪酸代謝、KRAS信號(hào)上調(diào)、肌細(xì)胞生成、NOTCH信號(hào)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路、致心律失常性心肌病、細(xì)胞因子受體相互作用、ECM受體相互作用、黏著斑、糖胺聚糖生物合成硫酸軟骨素、肥厚型心肌病、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)有關(guān)的基因集（圖4A、圖4B）。SPP1高表達(dá)的樣本富集了與血管新生、細(xì)胞凋亡、凝結(jié)、補(bǔ)體、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、糖酵解、組織缺氧、炎癥反應(yīng)、mTORC1信號(hào)、Myc目標(biāo)、糖酵解糖質(zhì)新生、致病性大腸桿菌感染、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、蛋白酶體等有關(guān)的基因集（圖4C、圖4D）；在GSEA中按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行富集分析，

P

＜0.05且FDR＜0.25的基因集判斷為顯著富集基因集。

圖4 GSEA分析COL10A1和SPP1相關(guān)富集基因集

3 討論

LUAD是最具侵襲性和快速致死性的腫瘤之一，其發(fā)病率在各種類型的肺癌中居第1位。發(fā)現(xiàn)LUAD特異性的早期診斷分子及治療靶標(biāo)，對(duì)于指導(dǎo)LUAD患者早期診斷和干預(yù)治療、提高患者生存率、改善患者生活質(zhì)量以及延長(zhǎng)生存期具有著重要意義。

COL10A1是一種液態(tài)非纖維膠原，是分布在細(xì)胞間質(zhì)中的主要間質(zhì)基質(zhì)成分。細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、進(jìn)展、凋亡和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。COL10A1在許多實(shí)體腫瘤類型中高表達(dá)，如結(jié)腸癌、食管癌和乳腺癌，并在許多關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、腫瘤血管生成，此外，COL10A1還與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。SPP1可能是多種腫瘤的潛在驅(qū)動(dòng)因素。SPP1在多個(gè)腫瘤相關(guān)生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括增殖、侵襲、遷移、血管生成和轉(zhuǎn)移。在胃癌和食管癌中，SPP1的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SPP1通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白促進(jìn)腫瘤發(fā)展。SPP1調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的許多功能，如刺激腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲、支持腫瘤血管生成。然而，COL10A1和SPP1蛋白在LUAD中的作用及其調(diào)控機(jī)制尚未得到很好的研究，COL10A1和SPP1在LUAD中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。

本研究分析了COL10A1和SPP1在LUAD中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LUAD組織中COL10A1和SPP1高表達(dá)。分析結(jié)果表明，在LUAD中COL10A1和SPP1表達(dá)上升是導(dǎo)致預(yù)后較差的因素之一。本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)樣本量大、臨床資料完整、可信度高。但是，數(shù)據(jù)庫(kù)提供的是

COL10A1

、

SPP1

mRNA變化情況，無(wú)法完全反映COL10A1和SPP1蛋白水平的變化情況。因此，應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)從蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)了SPP1在LUAD中表達(dá)量升高。

為了推測(cè)COL10A1和SPP1在LUAD發(fā)展過(guò)程中的功能，本研究利用GSEA方法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COL10A1的表達(dá)與血管新生、TGF-β信號(hào)通路、肌細(xì)胞生成、黏著斑、頂端連接、ECM受體相互作用、DNA修復(fù)、KRAS信號(hào)上調(diào)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、NOTCH信號(hào)通路等相關(guān)。因此，COL10A1可能與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)。另外，SPP1在血管新生、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、組織性缺氧、mTORC1信號(hào)、糖酵解糖質(zhì)新生、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白酶體等通路中大量富集，提示SPP1可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移、代謝和免疫功能相關(guān)。COL10A1和SPP1將成為L(zhǎng)UAD治療的新潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，LUAD樣本中COL10A1和SPP1的表達(dá)顯著增高，其功能可能參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、腫瘤的轉(zhuǎn)移、代謝和免疫調(diào)節(jié)。該研究將為后續(xù)深入研究COL10A1和SPP1在LUAD中具體作用的分子機(jī)制提供重要的臨床數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。