熊軒，劉昌淳，黎建文，邱越，周彩燕，鄭韜，嚴(yán)躍紅，梁劍波

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東佛山528315；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東佛山528315；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東廣州510799；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東廣州510260）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）一直是慢性腎病和腎功能衰竭的主要原因[1]。在過去的20年里，DN的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)迅速上升[2]。足細(xì)胞及足突之間裂孔隔膜是腎小球過濾的最后一道屏障，足細(xì)胞的增殖和凋亡對維持腎小球?yàn)V過屏障的完整性至關(guān)重要，對臨床DN治療具有重要意義[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過特異性翻譯抑制或者誘導(dǎo)mRNA降解，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡等，以及參與機(jī)體多種生理和病理過程[4?5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)許多miRNAs在DN患者中異常表達(dá)并參與足細(xì)胞增殖、凋亡、損傷等DN的病理過程[6?7]。已有研究報(bào)道m(xù)i R?873?5p在胃癌[8]、肺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]等癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但關(guān)于它在DN中的作用機(jī)制仍未完全明確。核內(nèi)不均一核糖核蛋白K（HNRNPK）定位于人第9染色體，是一種高度保守、廣譜表達(dá)的DNA/RNA結(jié)合蛋白，在腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。但HNRNPK在DN中的調(diào)控機(jī)制尚未十分清楚。本研究通過分析miR?873?5p和HNRNPK在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中表達(dá)，探討miR?873?5p是否通過靶向HNRNPK以影響高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

MPC5小鼠足細(xì)胞購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI?1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；葡萄糖購于美國Sigma公司；PCR引物、mi RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑盒購于日本Takara公司；miR?873?5p模擬物（mi R?873?5 mimic）、miR?873?5p抑制物（miR?873?5p inhibitor）和對照物（NC inhibitor）序列以及靶向HNRNPK的siR?NA序列（si?HNRNPK）和對照序列（si?NC）均購于上海吉碼公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Invitrogen公司；CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒、RI?PA裂解液、SDS?PAGE膠配制試劑盒均購于上海碧云天公司；Annexin?VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；iMark型酶標(biāo)儀購于美國BIO?RAD公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀購于美國Applied Biosystems公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MPC5細(xì)胞采用添加有10%(φ)胎牛血清的RP?MI?1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，以1×105個(gè)/mL細(xì)胞濃度將細(xì)胞接種至12孔板中，隨后置于37℃、5%(φ)CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。收集指數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了模擬糖尿病高糖損傷，在上述培養(yǎng)基中再添入終濃度為30 mol/L的葡萄糖建立高糖損傷細(xì)胞模型。高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后qRT?PCR檢測正常培 養(yǎng)（Cells）和 高 糖 培 養(yǎng)（H?Cells）細(xì) 胞 中miR?873?5p相對表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將細(xì)胞分為正常組（Cells）、高糖組（H?Cells）、高糖轉(zhuǎn)染對照組（H?NC inhibitor）、高糖miR?873?5p抑 制 劑 組（H?mi R?873?5p inhibitor）、H?miR?873?5p inhibitor+si?NC組、H?miR?873?5p inhibitor+si?HNRN?PK組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，經(jīng)葡萄糖誘導(dǎo)后的MPC5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后qRT?PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 qRT?PCR檢 測miR?873?5p和HNRNPK相 對表達(dá)

收集細(xì)胞，采用用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，隨后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此cDNA為模板，按照熒光PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系并在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中分別檢測miR?873?5p和HNRNPK表達(dá)水平。miR?873?5p相對表達(dá)水平以U6作為內(nèi)參，HNRNPK相對表達(dá)水平以GAPDH作為內(nèi)參。運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR?873?5p和HNRN?PK的相對表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞增殖檢測

采用CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒對各組細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測。將各組細(xì)胞接種至96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h，各組細(xì)胞經(jīng)各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)后，每孔加入10μL CCK8試劑，輕輕混勻，黑暗條件下37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。在450 nm波長下分別檢測各組細(xì)胞的吸光度（A)值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 流式檢測細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)箱中孵育48 h后，按照Annexin?VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對各組細(xì)胞進(jìn)行處理，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占比例。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

熒光素酶報(bào)告載體（psiCHECK2?HNRNPK?WT、psiCHECK2?HNRNPK?MUT）分別與miR?873?5 mim?ics、miR?873?5p inhibitor共轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書步驟操作，以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映miR?873?5p與HNRNPK的結(jié)合力。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集各組細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。各組取定量（20μg）變性的蛋白樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，然后將蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫條件下3%的胎牛血清封閉膜1 h。分別加入一抗：anti?HNRNPK抗體（1∶1 000）和anti?GAPDH抗體（1∶2 000），4℃條件孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜3次；室溫條件下經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3 000）孵育2 h，再TBST洗膜3次，采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（ECL）顯色測定各組蛋白條帶的光密度，以GAPDH條帶作為蛋白相對表達(dá)內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)資料以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中miR?873?5p表達(dá)

QRT?PCR結(jié)果表明，與對照組（1.00±0.05）相比，高糖組細(xì)胞中miR?873?5p相對表達(dá)水平（7.39±0.29）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 干擾miR?873?5p表達(dá)促進(jìn)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖

qRT?PCR結(jié)果顯示，在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor組細(xì)胞中miR?873?5p相對表達(dá)水平顯著低于轉(zhuǎn)染NC inhibitor的對照組（P＜0.05），見圖1A。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，高糖組細(xì)胞的增殖能力均顯著低于正常培養(yǎng)的細(xì)胞組（P＜0.05）。而培養(yǎng)24 h、48 h和72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibi?tor的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞組的增殖能力均顯著高于轉(zhuǎn)染NC inhibitor的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞組（P＜0.05），見圖1B。

2.3 干擾miR?873?5p表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞的凋亡比例顯著大于正常培養(yǎng)的細(xì)胞組（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞的凋亡比例顯著低于轉(zhuǎn)染NC inhibitor的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞組（P＜0.05）,見圖2。

2.4 miR?873?5p對HNRNPK表達(dá)的靶向調(diào)控作用

運(yùn)用miRcode數(shù)據(jù)庫對miR?873?5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR?873?5p與HNRNPK 3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，HNRNPK可能是miR?873?5p的靶基因,見圖3A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Blank組相比，mi R?873?5p mimics與WT?HNRNPK細(xì)胞中熒光活性顯著降低（P＜0.05），而miR?873?5p inhibitor與WT?HNRNPK細(xì)胞中熒光活性顯著上調(diào)（P＜0.05）；與Blank組相比,miR?873?5p mimics與MUT?HNRNPK細(xì)胞和miR?873?5p inhibitor與WT?HNRNPK細(xì)胞中熒光活性無明顯差異（P＞0.05）。見圖3B。qRT?PCR結(jié)果表明，與對照組相比，高糖組細(xì)胞中HNRNPK相對表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞中的HNRNPK相對表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染NC inhibitor的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞（P＜0.05）。見圖3C。

2.5 在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中干擾miR?873?5p的同時(shí)敲低HNRNPK的表達(dá)

設(shè)計(jì)3條靶向敲低HNRNPK表達(dá)的siRNA序列（si?RNA1、si?RNA2、si?RNA3），分別轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染si?NC序列作為對照。qRT?PCR和Western blot結(jié)果均顯示，與轉(zhuǎn)染si?NC序列相比，轉(zhuǎn)染靶向敲低HNRNPK表達(dá)的si RNA序列（si?RNA1、si?RNA2和si?RNA3）均能敲低HNRNPK mRNA和蛋白的表達(dá)（P＜0.05），但是si?RNA1效果最顯著，所以在后續(xù)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)染si?RNA1（si?HNRNPK）靶向敲低HNRNPK表達(dá)。見圖4A和圖4B。隨后在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中干擾mi R?873?5p的同時(shí)敲低HNRNPK的表達(dá)，qRT?PCR和Western blot結(jié)果均顯示，與轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor+si?NC組相比，轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor+si?HNRNPK細(xì)胞中HNRNPK mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.05）。見圖4C和圖4D。

圖1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測干擾miR?873?5p表達(dá)對高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of miR?873?5p interference on podocyte proliferation in high glucose culture by CCK8 assay

圖2 細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)檢測干擾miR?873?5p表達(dá)對高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of mi R?873?5p interference on podocyte apoptosis in high glucose culture by flow cytometry assay

2.6 干擾miR?873?5p表達(dá)同時(shí)干擾HNRNPK的表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)48 h和72 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor+si?HNRN?PK的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖能力均顯著低于轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor+si?NC的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞組（P＜0.05）。見圖5。

圖3 miR?873?5p對HNRNPK表達(dá)的靶向調(diào)控作用Figure 3 Effect of miR?873?5p on the expression of HNRNPK

圖4 在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中干擾mi R?873?5p的同時(shí)干擾HNRNPK的表達(dá)Figure 4 Interference of miR?873?5p and HNRNPK expression in podocytes cultured with high glucose

圖5 干擾miR?873?5p表達(dá)同時(shí)干擾HNRNPK的表達(dá)對高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖的影響Figure 5 Effect of miR?873?5p and HNRNPK interference on podocyte proliferation in high glucose culture

2.7 干擾miR?873?5p表達(dá)同時(shí)干擾HNRNPK的表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhi?bitor+si?HNRNPK的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞的凋亡比例顯著高于轉(zhuǎn)染miR?873?5p inhibitor+si?NC的高糖培養(yǎng)的細(xì)胞組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 干擾miR?873?5p表達(dá)同時(shí)干擾HNRNPK的表達(dá)對高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡的影響Figure 6 Effect of mi R?873?5p and HNRNPK interference on podocyte apoptosis in high glucose culture

3 討論

雖然近些年關(guān)于DN發(fā)病機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，但其高發(fā)率和不良預(yù)后并沒有得到很大改善，尋找新的治療DN靶點(diǎn)具有重要意義[12]。足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞脫離和足細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致DN患者尿蛋白的增加[13]。因此，足細(xì)胞增殖和凋亡在DN發(fā)病中占有重要地位。近年來越來越多的研究表明異常表達(dá)的miRNAs在糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用[14]。比如，在高糖處理的足細(xì)胞中，miR?770?5p的表達(dá)水平上調(diào)，干擾miR?770?5p表達(dá)通過靶向TRIAP 1抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[15]。MiR?15b?5p通過抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和靶向SEMA3A的炎癥反應(yīng)，改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[16]。miR?873?5p作為miRNAs家族的一員，已被證明在人類腫瘤中發(fā)揮重要作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR?873?5p通過NF?κB通路直接靶向JMJD8抑制細(xì)胞增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Wang等[17]報(bào)道m(xù)iR?873?5p通過抑制IGF2BP 1的表達(dá)，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。然而，關(guān)于miR?873?5p在DN中的功能尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，miR?873?5p在高糖處理足細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示miR?873?5p可能參與調(diào)控足細(xì)胞的增殖和凋亡；隨后研究發(fā)現(xiàn)干擾miR?873?5p的表達(dá)可促進(jìn)高糖處理的足細(xì)胞的增殖，提示干擾miR?873?5p表達(dá)對高糖處理的足細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。表明以長期高血糖為表型的糖尿病引起的腎病可能通過誘導(dǎo)miR?873?5p高表達(dá)抑制足細(xì)胞的增殖有關(guān)。腎足細(xì)胞凋亡是慢性腎病、小兒腎病綜合征及局灶節(jié)段性腎小球硬化等多種腎臟疾病的重要發(fā)病機(jī)制[18]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR?873?5p的表達(dá)能夠抑制高糖處理的足細(xì)胞的凋亡，表明糖尿病引起的腎病還可能通過誘導(dǎo)miR?873?5p高表達(dá)促進(jìn)足細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

為了探討miR?873?5p在DN進(jìn)展中的作用機(jī)制，本研究通過在線工具預(yù)測miR?873?5P與HNRNPK有理論結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，異常表達(dá)的HNRNPK與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)[19]。HNRNPK表達(dá)下調(diào)能夠明顯減少轉(zhuǎn)移性肺腫瘤結(jié)節(jié)的形成[20]。此外，HNRNPK在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中也起著重要作用。HNRNPK作為p53的輔助激活因子，對DNA損傷修復(fù)起調(diào)節(jié)作用，下調(diào)HNRNPK可降低p53的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA損傷所致的細(xì)胞周期阻滯[21]。Su等[22]發(fā)現(xiàn)HNRNPK在糖尿病腎病大鼠中低表達(dá)，而Hordenine治療能夠促進(jìn)HNRNPK的表達(dá)。隨后的熒光素酶分析表明，HNRNPK是miR?873?5P的靶點(diǎn)。同Su等結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中低表達(dá)，而干擾miR?873?5p表達(dá)時(shí)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中HNRNPK表達(dá)顯著上調(diào)。表明在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中miR?873?5p的表達(dá)與HNRNPK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。mi R?873?5P通過與HNRNPK mRNA 3’UTR結(jié)合，下調(diào)HNRNPK的表達(dá)。隨后對HNRN?PK在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中功能研究發(fā)現(xiàn)，干擾miR?873?5p表達(dá)的同時(shí)敲低HNRNPK表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)干擾mi R?873?5p表達(dá)對高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制的作用。表明miR?873?5p通過靶向HNRNPK調(diào)控高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，miR?873?5p在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中高表達(dá)，干擾miR?873?5p表達(dá)通過靶向下調(diào)HNRN?PK表達(dá)，促進(jìn)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖和抑制凋亡。miR?873?5p和HNRNPK可能成為DN臨床治療的潛在靶點(diǎn)。