陳鴻運(yùn)，李曉明，黃國勝，楊金華，喬飛

（南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科，河南南陽473000）

肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌形成的直接原因，在肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中微管形成和間質(zhì)細(xì)胞的增加會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程異常并最終形成肺癌[1]。目前，臨床上肺癌的治療方法主要有放化療和手術(shù)切除，但治療效果都不理想，且具有副作用。牡荊葡基黃酮（Vitexin）是一種芹菜素黃酮苷，主要存在于食用植物和藥用植物中。研究表明，牡荊葡基黃酮通過抗氧化、抗炎癥、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等生物活性在多種疾病及腫瘤預(yù)防中發(fā)揮重要調(diào)控作用[2?5]。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，牡荊葡基黃酮給藥處理肺癌A549細(xì)胞會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。趙培等[7]發(fā)現(xiàn)，牡荊葡基黃酮能抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，本研究選擇不同劑量牡荊葡基黃酮處理肺癌A549細(xì)胞，觀察肺癌細(xì)胞侵襲和遷移，微管形成和間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時，利用裸鼠成瘤體內(nèi)實驗驗證牡荊葡基黃酮給藥治療效果，探討牡荊葡基黃酮在肺癌細(xì)胞中的調(diào)控作用，為牡荊葡基黃酮在肺癌中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 牡荊葡基黃酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；人肺癌A549細(xì)胞株由四川大學(xué)華西醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究中心/衛(wèi)生部移植工程和移植免疫重點(diǎn)實驗室提供，將細(xì)胞放置在含10%（φ）胎牛血清（fetal bovine se?rum，F(xiàn)BS）、0.1 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Giboc公司；E?cadherin、N?cadherin抗體、免疫組化檢測試劑盒PV?6000和DAB顯色液均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；Anti?Fibronectin Rabbit pAb購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司；RT?6100酶標(biāo)儀（Rayto）；D3024R臺式高速離心機(jī)（DRAGONLAB）；MS?PB磁力攪拌器（Servicebio）；TSY?B脫色搖床（Servicebio）；BV?2電泳儀（Servicebio）；V370掃描儀（EPSON）；KE0003087移液槍（Dragon）；E100顯微鏡（Nikon）；Nikon DS?U3成像系統(tǒng)（日本尼康）。

1.1.2 實驗動物 20只雄性SPF級Balb/c裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2017?0022。動物飼養(yǎng)條件：每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格、規(guī)范的卡片登記管理，24℃條件下獨(dú)立飼養(yǎng)，建模前24 h小鼠禁食不禁水。

1.1.3 動物分組、建模及給藥 將20只雄性Balb/c裸鼠隨機(jī)分為對照組和給藥組（n=10），將生長至對數(shù)期的肺癌A549細(xì)胞配制成2×105個/mL濃度的細(xì)胞懸浮液，取200μL細(xì)胞懸浮液接種到裸鼠皮下，建立移植瘤裸鼠模型，參照文獻(xiàn)[8]給藥組腹腔注射0.1 mL生理鹽水（含Vitexin 2 mg/kg），對照組同時注射等量的生理鹽水，持續(xù)4周。觀察腫瘤體積，每5天用直尺測量1次腫瘤體積（體積=0.52×最長直徑×最長橫徑），培養(yǎng)30 d后檢測腫瘤質(zhì)量。

1.2 方法

1.2.1 CCK8篩選Vitexin劑量 培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞株，待細(xì)胞90%融合后，用不同濃度的Vitexin處理細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞鋪入96孔板，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，放入5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后將配好的CCK8溶液按每孔10μL加入，37℃恒溫箱內(nèi)避光繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，最后將96孔板放入酶標(biāo)儀，450 nm處測定吸光度（A）值。

1.2.2 Transwell檢測肺癌A549細(xì)胞侵襲能力 將不同濃度Vitexin處理的肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化、離心并重懸細(xì)胞。基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基按1∶8（V:V）的比例混合均勻，加入transwell細(xì)胞小室中，小室上室加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，基質(zhì)膠底層加入完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于上室中培養(yǎng)30 min使其處于饑餓狀態(tài)，然后將細(xì)胞小室置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1 h。Tran?swell小室接種肺癌細(xì)胞（3×104/孔）檢測細(xì)胞侵襲能力。24 h后取出細(xì)胞小室，多聚甲醛固定60 min后用結(jié)晶紫染色20 min，隨機(jī)選取5～10個視野用顯微鏡拍照并計數(shù)。

1.2.3劃痕實驗檢測肺癌A549細(xì)胞遷移能力 使用6孔板接種適量對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/孔，將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的Vitexin處理肺癌A549細(xì)胞24 h。24 h后去掉培養(yǎng)基用牙簽在孔內(nèi)均勻地劃痕，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并于劃痕后0 h和24 h在同一位置觀察拍照，分析細(xì)胞遷移距離。

1.2.4 成管實驗檢測肺癌A549細(xì)胞微管形成能力 實驗前先將96孔板和槍頭預(yù)冷，然后將50μL Matrigel加入96孔板中，放入37℃孵箱中0.5 h。用胰酶消化各組肺癌細(xì)胞并用ECM培養(yǎng)基重懸，以2×106個細(xì)胞種入96孔板中，12 h后顯微鏡下觀察拍照，使用Image J計算分析微管結(jié)節(jié)數(shù)目。

1.2.5 Western blot檢測E?cadherin、N?cadherin和FN表達(dá)水平 使用胰酶消化細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。10%SDS?PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后加入5%的脫脂牛奶室溫封閉120 min。待封閉完成后，棄掉封閉液，加入一抗于4℃下封閉過夜。次日滴加二抗室溫封閉60 min，最后加入ECL顯色液曝光顯影。獨(dú)立重復(fù)實驗3次，取平均值。

1.2.6 免疫組化檢測E?cadherin和N?cadherin表達(dá)水平 按Envision二步法和免疫組化檢測試劑盒（PV?6000）說明操作，將石蠟切片脫蠟至水，室溫孵育5～10 min，用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，切片放入3%H2O2溶液中室溫避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA封閉30 min，加入一抗孵育過夜，加二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用PBS代替一抗作陰性對照。蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出來的陽性信號為棕黃色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS17.0軟件分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用L S D法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8篩選Vitexin劑量

用不同劑量Vitexin處理肺癌A549細(xì)胞株24 h，CCK8篩選合適的Vitexin劑量（圖1）。不同濃度Vitexin濃度處理后，各組的細(xì)胞活力見圖1。25μmol/L Vitexin處理后，細(xì)胞活力開始下降，50 μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后細(xì)胞活力顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），200μmol/L和400μmol/L Vitexin處理后細(xì)胞活力極低，太高濃度的Viteixin對細(xì)胞活力會產(chǎn)生強(qiáng)抑制性，導(dǎo)致無法觀測影響作用，因此，50μmol/L和100μmol/L Vitexin為最佳藥物觀測劑量。

圖1 CCK8篩選合適的Vitexin劑量Figure 1 CCK8 screening the appropriate dose of Vitexin

2.2 Vitexin對肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell檢測肺癌A549細(xì)胞侵襲數(shù)目，結(jié)果如圖2所示，同一視野下各組侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為Vitexin 0μmol/L（102±14）、25μmol/L（93±18）、50μmol/L（38±7）、100μmol/L（18±9）個。與Vitexin 0μmol/L組相比，25μmol/L Vitexin對肺癌A549細(xì)胞的侵襲沒有明顯抑制作用（P＞0.05），經(jīng)50μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后，肺癌A549細(xì)胞侵襲數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明Vitexin對肺癌A549細(xì)胞侵襲具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.3 Vitexin對肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗檢測肺癌A549細(xì)胞株遷移能力，與處理0 h相比，Vitexin處理24 h后各組均有明顯的遷移，見圖3A。24 h后細(xì)胞遷移率（%）分別為Vitexin 0μmol/L（78±7）、25μmol/L（74±8）、50μmol/L（57±6）、100μmol/L（35±9）。與Vitexin 0μmol/L組相比，Vitexin 25μmol/L組的遷移率差異不明顯（P＞0.05），50μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后，肺癌細(xì)胞遷移率顯著下降，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。結(jié)果表明，Vitexin對肺癌細(xì)胞的遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.4 Vitexin對肺癌A549細(xì)胞微管形成的影響

成管實驗檢測肺癌A549細(xì)胞微管數(shù)目變化，結(jié)果如圖4所示，各組微管節(jié)點(diǎn)數(shù)分別為Vitexin

0μmol/L（84±7）、25μmol/L（78±9）、50μmol/L（43±10）、100μmol/L（26±6）。與Vitexin 0μmol/L組相比，Vitexin25μmol/L組微管節(jié)點(diǎn)數(shù)無明顯差異（P＞0.05），50μmol/L和100μmol/L Vitexin處理后，A549細(xì)胞微管數(shù)目顯著減少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明Vitexin抑制肺癌細(xì)胞微管形成，且呈劑量依賴性。

圖2 Transwell檢測肺癌A549細(xì)胞侵襲能力Figure 2 Detection of invasive ability of lung cancer A549 cells by Transwell

圖3 劃痕實驗檢測肺癌A549細(xì)胞遷移率Figure 3 Detection of the migration rate of lung cancer A549 cells by scratch test

圖4 肺癌A549細(xì)胞株成管檢測Figure 4 Tube formation of lung cancer A549 cells

2.5 Vitexin對 肺 癌A549細(xì) 胞E?cadherin、N?cad?herin、FN表達(dá)水平的影響

Western blot檢測E?cadherin、N?cadherin和纖維黏蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，各組E?cadherin蛋白表達(dá)水平分別為Vitexin 0μmol/L（0.06±0.03）、25μmol/L（0.07±0.04）、50μmol/L（0.24±0.07）、100 μmol/L（0.88±0.09），N?cadherin蛋白表達(dá)水平分別為Vitexin 0μmol/L（0.54±0.08）、25μmol/L（0.52±0.06）、50μmol/L（0.18±0.05）、100μmol/L（0.03±0.01），F(xiàn)N蛋白表達(dá)水平分別為Vitexin 0μmol/L（0.58±0.05）、25μmol/L（0.54±0.07）、50μmol/L（0.17±0.03）、100μmol/L（0.05±0.04）。與Vitexin 0μmol/L組相比，Vitexin 25μmol/L組E?cadherin、N?cadherin、FN蛋白表達(dá)水平差異均無明顯差異。50μmol/L和100μmol/LVitexin給藥處理后，E?cadherin、N?cad?herin、FN蛋白表達(dá)水平差異顯著，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明，Vitexin通過調(diào)節(jié)E?cad?herin、N?cadherin和FN蛋白表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.6 Vitexin對腫瘤生長的影響

裸鼠成瘤體內(nèi)實驗檢測Vitexin給藥治療效果，腫瘤體積變化如圖6A所示。直尺測量30 d內(nèi)腫瘤體積（5 d/次），結(jié)果如圖6B所示，未給藥組腫瘤體積（V/mm3）分別為25±9、68±15、215±65、518±84、1165±254、2314±387，Vitexin 2 mg/kg組腫瘤體積（V/mm3）分別為15±7、32±9、78±36、198±64、426±117、925±176。30 d后稱取腫瘤質(zhì)量，結(jié)果如圖6C所示，未給藥組腫瘤質(zhì)量為（0.40±0.07）g，Vitexin 2 mg/kg組腫瘤質(zhì)量為（0.15±0.05）g。與未給藥組相比，2 mg/kg Vitexin給藥治療后，腫瘤體積明顯變小，質(zhì)量明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。利用免疫組化檢測裸鼠中E?cadherin和N?cadherin陽性細(xì)胞率，結(jié)果如圖6D所示，E?cadherin陽性細(xì)胞率(%)分別為7±5、28±8，N?cadherin陽性細(xì)胞率分別為57±9、11±6。與未給藥組相比，Vitexin 2 mg/kg顯著增加E?cadherin陽性細(xì)胞率，減少N?cadherin陽性細(xì)胞率，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果說明Vitexin抑制腫瘤生長及間質(zhì)轉(zhuǎn)換。

3 討論

牡荊葡基黃酮作為傳統(tǒng)中藥，具有天然無毒副作用、藥效佳等特點(diǎn)，常用于心血管等疾病中，已有研究報道，牡荊葡基黃酮在腫瘤及癌癥中具有調(diào)控效果[9?10]。本研究旨在探索牡荊葡基黃酮對肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移、微管形成、間質(zhì)轉(zhuǎn)換及腫瘤生長的影響作用，為肺癌診斷與治療提供新的藥物。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)中高濃度牡荊葡基黃酮處理后，肺癌細(xì)胞活力明顯降低，與趙蓓等[7]的研究結(jié)果相符，結(jié)果提示牡荊葡基黃酮在肺癌細(xì)胞中具有調(diào)控作用。

圖5 Westerrn blot檢測E?cadherin、N?cadherin和FN蛋白表達(dá)水平Figure 5 Expression of E?cadherin,N?cadherin and FN protein by western blot

腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移是腫瘤擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移的前提條件，腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞通過其分泌的酶類物質(zhì)突破附近細(xì)胞的外基質(zhì)，入侵周圍組織細(xì)胞，達(dá)到侵襲的目的。而腫瘤遷移是指腫瘤細(xì)胞依靠其運(yùn)動及形變能力從一個組織或部位向另一個組織或部位移動的過程[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50、100μmol/L牡荊葡基黃酮能顯著抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，且呈劑量依賴性。結(jié)果提示，牡荊葡基黃酮通過抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移降低肺癌細(xì)胞活力。

圖6 Vitexin對肺癌生長和EMT的影響Figure 6 Effect of Vitexin on lung cancer cell growth and EMT

微管是由微管蛋白和輔助蛋白組成的中空管狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞分裂、細(xì)胞形態(tài)、物質(zhì)運(yùn)輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞增殖過程中，微管通過聚合為紡錘體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞有絲分裂過程，同時，促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Zheng等[13]也指出，微管介導(dǎo)并抑制自噬溶酶體的形成阻遏非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)牡荊葡基黃酮處理后，肺癌細(xì)胞微管數(shù)量明顯減少，結(jié)果進(jìn)一步說明牡荊葡基黃酮通過降低微管形成抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移。

間質(zhì)轉(zhuǎn)換是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換的過程，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，胞間連接緊密且具有較強(qiáng)的細(xì)胞極性，而間質(zhì)細(xì)胞則與之相反，胞間結(jié)構(gòu)疏松，缺乏細(xì)胞極性，具有極強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14]。E?cadherin是上皮細(xì)胞緊密連接和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要調(diào)節(jié)蛋白，在上皮組織中往往高表達(dá)，同時抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。N?cadherin和FN則與之相反，兩者能夠降低細(xì)胞間的黏附性，提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16?17]。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)E?cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)N?cadherin蛋白表達(dá)能有效抑制間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程[18?19]。吳安邦等[20]通過實驗證實在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中E?cadherin高表達(dá)，N?cadherin低表達(dá)。本實驗結(jié)果顯示，牡荊葡基黃酮下調(diào)N?cadherin和FN蛋白表達(dá)，上調(diào)E?cad?herin蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性。結(jié)果提示，牡荊葡基黃酮通過調(diào)節(jié)E?cadherin和N?cadherin蛋白表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程和侵襲轉(zhuǎn)移。

已有研究表明，牡基葡基黃酮對肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為具有抑制作用[6?7]，但牡荊葡基黃酮對腫瘤生長的影響及給藥治療效果未見報道，因此，本研究前期工作主要檢測牡荊葡基黃酮在肺癌細(xì)胞侵襲遷移、微管形成和間質(zhì)轉(zhuǎn)換中的調(diào)控作用，為進(jìn)一步明確牡荊葡基黃酮在肺癌中的藥理作用，本研究利用裸鼠成瘤體內(nèi)實驗觀測牡荊葡基黃酮對腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，牡荊葡基黃酮給藥治療后顯著抑制成瘤裸鼠腫瘤生長，同時抑制N?cadherin蛋白表達(dá)，上調(diào)E?cadherin表達(dá)。結(jié)果提示，牡荊葡基黃酮可作為肺癌診斷和治療的潛在藥物。

綜上所述，牡荊葡基黃酮在肺癌細(xì)胞侵襲和遷移、微管形成、間質(zhì)轉(zhuǎn)換和腫瘤生長中具有抑制作用，但具體的抑制作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。后續(xù)實驗計劃探究牡荊葡基黃酮在肺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，為牡荊葡基黃酮的臨床應(yīng)用提供更完善的實驗基礎(chǔ)。