劉瑤，盧素宏，歐陽(yáng)蒲月

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種最常見(jiàn)的胃腸道功能紊亂性疾病，該病患病率高、病程長(zhǎng)、易反復(fù)、治療困難、嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，引起人們廣泛重視[1]?；颊弑荒c道病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)等感染，在病原體清除及黏膜炎癥逐漸消退后，出現(xiàn)IBS癥狀，稱(chēng)之為感染后腸易激綜合征(post?infectious irritable bowel syndrome,PI?IBS)。PI?IBS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，內(nèi)臟高敏感是PI?IBS癥狀產(chǎn)生的核心機(jī)制[2]。本課題組前期研究結(jié)果表明，藿香正氣液、廣藿香油、廣藿香醇均能不同程度地修復(fù)PI?IBS大鼠腸黏膜機(jī)械屏障，調(diào)節(jié)腸道免疫異常和菌群失調(diào)，藿香正氣制劑可作為治療PI?IBS的理想藥物[3]。廣藿香Pogostemoncablin(Bl anco)Benth.是藿香正氣方中的君藥，在治療PI?IBS中起主要作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，廣藿香具有調(diào)節(jié)胃腸道功能和抑菌抗炎作用[4]。但廣藿香能否顯著改善PI?IBS內(nèi)臟高敏感性，廣藿香不同提取物（廣藿香水提液、廣藿香油）對(duì)PI?IBS大鼠腸道脊髓轉(zhuǎn)入神經(jīng)通路的影響是否有差異，均有待于進(jìn)一步研究。因此，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，深入研究廣藿香對(duì)PI?IBS大鼠內(nèi)臟高敏感的調(diào)控作用及其機(jī)制，為廣藿香合理應(yīng)用于PI?IBS臨床治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，為中醫(yī)藥對(duì)PI?IBS的認(rèn)識(shí)以及診療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague?Dawley大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雄性，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013?0002。動(dòng)物于20～24℃，濕度60%～70%，12 h明暗的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

廣藿香藥材采自廣東省高要市。廣藿香揮發(fā)油制備：取廣藿香地上部分，晾干剪碎后，精密稱(chēng)取碎葉置于蒸餾瓶中，加入適量蒸餾水，按《中國(guó)藥典》規(guī)定的揮發(fā)油測(cè)定法提得黃色油狀物，出油率為1.5%。廣藿香水提液的制備：收集廣藿香揮發(fā)油提取后的濾渣，濾渣用蒸餾水煎煮3次并過(guò)濾，棄去濾渣，合并濾液，為廣藿香水提液。馬來(lái)酸曲美布汀片（開(kāi)開(kāi)援生制藥股份有限公司，批號(hào)13032817）；CRF、CGRP、5?HT檢測(cè)試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司，貨號(hào)分別為：c12031、c12421、c12311）；BDNF一抗（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab122424）；ECL檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ThermoFisher公司，批號(hào)：32019）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，由廣州浩瑪生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

5810R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；POW?ER/PAC 1000電泳儀、POWER/PAC Universal電轉(zhuǎn)裝置、GS?800光密度掃描儀（美國(guó)BIO?RAD公司）；MP150型多導(dǎo)生理記錄分析系統(tǒng)（美國(guó)BIOPAC公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組、造模及給藥方法 40只大鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、PI?IBS模型組、馬來(lái)酸曲美布汀片（TMT）組[0.1 g/(kg·d）]、廣藿香油組[3 g/(kg·d）]、廣藿香水提物組[6 g/(kg·d）]，每組8只。參考課題組前期文獻(xiàn)復(fù)制PI?IBS模型[5]。造模成功后第2天開(kāi)始給藥，正常對(duì)照組和PI?IBS模型組給予生理鹽水灌胃，藥物組給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。

1.4.2 大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)能力和內(nèi)臟敏感性測(cè)定 于建模前、給藥前及給藥后測(cè)定大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)和結(jié)腸運(yùn)動(dòng)。大鼠2 h內(nèi)排便的糞粒數(shù)：清早未刺激前2 h內(nèi)大鼠排便的糞粒數(shù)。大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的描記：將橡膠小囊與直徑為2 mm的塑料導(dǎo)管連接，將塑料導(dǎo)管與三通管（一端接壓力換能器，另一端接1 mL的注射器）連接，注射器注入水，排凈氣泡，將壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連，記錄30 min結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的曲線。然后計(jì)算連續(xù)30 min的曲線下面積為大鼠的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)(motility index，MI)。用藥前及用藥結(jié)束后進(jìn)行內(nèi)臟敏感性評(píng)估，行直腸氣囊擴(kuò)張（colon rectal distension，CRD），根據(jù)腹部回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]確定疼痛壓力閾值。

1.4.3 ELISA檢測(cè)結(jié)腸中CRF、CGRP、5?HT含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉后量取距肛門(mén)8 cm處取結(jié)腸組織2 cm。加3倍體積生理鹽水勻漿后，按照ELISA試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)CRF、CGRP、5?HT含量。

1.4.4 Western blot檢測(cè)大鼠海馬中BDNF表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉后取腦組織。按說(shuō)明書(shū)提取蛋白并測(cè)定濃度。每孔上樣50μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗溶液（BDNF 1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜，10 min/次，3次，HRP標(biāo)記的二抗溶液（1∶15 000）室溫孵育2 h，上述方法洗膜后加入ECL液顯色曝光。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣藿香提取物對(duì)大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的影響

造模前，各組大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)和結(jié)腸MI無(wú)差異。造模后，PI?IBS大鼠排出的糞粒數(shù)和結(jié)腸MI較正常組顯著增加(P＜0.01)。給藥后，廣藿香油組、廣藿香水提物組、TMT組大鼠2 h內(nèi)排出糞粒數(shù)和結(jié)腸MI較模型組均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。廣藿香油組、廣藿香水提物組大鼠2 h內(nèi)糞粒數(shù)明顯多于TMT組，大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)也明顯高于TMT組。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.2 廣藿香提取物對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與正常組相比，用藥前各組大鼠直腸擴(kuò)張時(shí)的疼痛閾值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，廣藿香油組、廣藿香水提液組、TMT組疼痛閾值明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。廣藿香油組、廣藿香水提液組與TMT組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠2 h內(nèi)糞粒數(shù)（個(gè)）Table 1 Number of fecal particles in each group within 2 h(±s，n=8)

表1 各組大鼠2 h內(nèi)糞粒數(shù)（個(gè)）Table 1 Number of fecal particles in each group within 2 h(±s，n=8)

與正常對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與TMT組比較：△P＜0.05。

組別正常對(duì)照PI?IBS模型TMT廣藿香油廣藿香水提物劑量/（g·kg?1）--0.1 3 6建模前4.7±1.16 4.6±1.27 4.5±0.97 4.8±0.79 4.6±0.85給藥前4.5±1.08 7.5±1.35**7.6±1.71**7.4±1.89**7.3±1.57**給藥后4.6±0.97 7.3±1.64**5.5±1.08##6.6±1.33#△6.7±1.32#△

表2 各組大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)Table 2 Colonic motility index of rats in each group（mmHg·s-1，±s，n=8）

表2 各組大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)Table 2 Colonic motility index of rats in each group（mmHg·s-1，±s，n=8）

與正常對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對(duì)照PI?IBS模型TMT廣藿香油廣藿香水提物劑量/（g·kg?1）? ?0.1 36建模前1 073.4±95.12 1 039.15±91.27 1 090.29±105.97 1 090.51±112.79 1 082.7±108.85給藥前1 096.65±154.08 2 092.27±183.35**2 111.88±179.71**2 097.4±197.26**2 063.43±249.82**給藥后1 086.22±93.47 2 112.15±107.2**1 470.92±86.85##1 870.12±85.93#△1 880.64±93.5#△

2.3 廣藿香提取物對(duì)大鼠結(jié)腸組織中CRF、CGRP、5?HT的影響

表3 各組大鼠疼痛閾值（60 mmHg）Table 3 Pain threshold of rats in each group(±s，n=8）

表3 各組大鼠疼痛閾值（60 mmHg）Table 3 Pain threshold of rats in each group(±s，n=8）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

?

與正常組相比，PI?IBS大鼠結(jié)腸組織中CRF、CGRP和5?HT含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。給藥后，廣藿香油組、廣藿香水提物組、TMT組結(jié)腸中CRF、CGRP和5?HT含量較模型組顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。3個(gè)給藥組大鼠的結(jié)腸中CGRP含量仍明顯高于正常組（P＜0.01）。廣藿香油組、廣藿香水提液組與TMT組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 廣藿香提取物對(duì)大鼠腦組織中BDNF的影響

與正常組相比，模型組海馬中BDNF表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，廣藿香油組、廣藿香水提液組和TMT組，海馬組織中BDNF表達(dá)均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。廣藿香油組、廣藿香水提液組與TMT組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3 討論

內(nèi)臟高敏感性是指內(nèi)臟器官對(duì)來(lái)自外周的各類(lèi)傷害性刺激和正常生理性刺激的感覺(jué)閾值降低、感受性加強(qiáng)的現(xiàn)象?，F(xiàn)代研究表明，內(nèi)臟高敏感是PI?IBS癥狀產(chǎn)生的核心機(jī)制，腸道內(nèi)持續(xù)存在的低度炎癥是使外周神經(jīng)末梢致敏的重要原因。持續(xù)的炎癥不僅釋放各種炎性介質(zhì)包括前列腺素、緩激肽、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等，還通過(guò)刺激EC細(xì)胞增生釋放5?HT，影響胃腸道神經(jīng)和平滑肌的功能，引起胃腸動(dòng)力異常和內(nèi)臟感覺(jué)過(guò)敏。

圖1 各組大鼠海馬BDNF的水平Figure 1 Levels of BDNF in hippocampus of rats in each group(±s，n=4)

5?HT作為一種具有多種生物功能廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)積極參與了上述生理病理過(guò)程，并與PI?IBS患者腹痛、腹瀉及內(nèi)臟敏感等癥狀密切相關(guān)[7]。腸道內(nèi)5?HT的增加，會(huì)導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)高度敏感，激活多種神經(jīng)活性物質(zhì)，導(dǎo)致腦?腸軸內(nèi)信號(hào)異常；而5?HT還作用于相關(guān)受體，導(dǎo)致患者腸道的感知、運(yùn)動(dòng)和分泌改變，產(chǎn)生IBS的癥狀[8?9]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)是一種能夠介導(dǎo)下丘腦?垂體?腎上腺軸(HPA軸)產(chǎn)生各種應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽。應(yīng)激可以刺激下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞釋放CRF，CRF能夠激活肥大細(xì)胞，使其脫顆粒釋放5?HT，改變胃腸動(dòng)力，提高內(nèi)臟敏感性。因此，CRF可能通過(guò)對(duì)5?HT表達(dá)的調(diào)控來(lái)影響PI?IBS的內(nèi)臟敏感性[10?12]。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織CRF、CGRP、5?HT的水平Table 4 Levels of CRF,CGRP and 5?HT in colon tissue of rats in each group（±s，n=8）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織CRF、CGRP、5?HT的水平Table 4 Levels of CRF,CGRP and 5?HT in colon tissue of rats in each group（±s，n=8）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對(duì)照PI?IBS模型TMT廣藿香油廣藿香水提物劑量/（g·kg-1）--0.1 36 CRF/(ng·mg-1)3.85±0.28 4.89±0.68*3.09±0.26#3.17±0.19##3.15±0.34##5?HT/(ng·mg-1)3.22±0.18 4.78±0.36*3.53±0.45#2.85±0.43##2.89±0.51##CGRP/(ng·mg-1)2.51±0.16 4.54±0.25**3.95±0.27*#3.82±0.43*#3.85±0.47*#

TMT是一種胃腸運(yùn)動(dòng)節(jié)律調(diào)節(jié)劑，是IBS及其他一些胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病的常用治療藥物。其可作用于平滑肌細(xì)胞膜中的Ca2+、K+通道，對(duì)腸道運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生抑制和興奮的雙重作用。此外，TMT對(duì)平滑肌神經(jīng)受體也有雙向調(diào)節(jié)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)選用TMT作為治療PI?IBS的對(duì)照藥物。結(jié)果顯示，TMT組給藥后各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于模型組。結(jié)果提示，TMT亦能改善PI?IBS大鼠內(nèi)臟高敏感性。

本實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定結(jié)果顯示，給藥后，TMT組、廣藿香油組、廣藿香水提物組大鼠2 h內(nèi)排出糞粒數(shù)和結(jié)腸MI均顯著降低(P＜0.05)，TMT組對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)作用優(yōu)于廣藿香油組和廣藿香水提物組。給藥后，TMT組、廣藿香油組、廣藿香水提物組大鼠直腸擴(kuò)張時(shí)的疼痛閾值明顯上升。廣藿香油組、廣藿香水提物組對(duì)直腸擴(kuò)張時(shí)的疼痛閾值的改善作用優(yōu)于TMT組。

PI?IBS模型組大鼠結(jié)腸組織中CRF與5?HT表達(dá)均顯著升高，而5?HT的異常升高會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)臟敏感性和腸道動(dòng)力異常，證明CRF和5?HT的表達(dá)異常與PI?IBS的發(fā)生有密切關(guān)系。給予廣藿香提取物干預(yù)后，廣藿香提取物能夠明顯降低PI?IBS模型大鼠結(jié)腸內(nèi)CRF與5?HT的含量，說(shuō)明廣藿香可能是通過(guò)下調(diào)PI?IBS模型大鼠結(jié)腸CRF的表達(dá)，影響肥大細(xì)胞釋放5?HT，降低了結(jié)腸內(nèi)5?HT的含量，從而改善PI?IBS的相關(guān)癥狀。與TMT組比較，廣藿香油組和廣藿香揮發(fā)油組下調(diào)CRF與5?HT的作用優(yōu)于TMT組。

CGRP是一種主要的炎癥促進(jìn)型的感覺(jué)神經(jīng)肽，在結(jié)腸固有膜血管壁表達(dá)尤其豐富，且在腸壁各層均有分布，具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、血流及分泌的功能。作為調(diào)節(jié)介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)的CGRP有促炎作用，能直接產(chǎn)生傷害作用，還參與內(nèi)臟傷害性遞質(zhì)的傳遞[14]。本研究顯示，與模型組比較，廣藿香油、廣藿香水提物、TMT均可以顯著降低PI?IBS大鼠結(jié)腸CGRP含量，但CGRP水平仍明顯高于正常組。結(jié)果提示，廣藿香提取物和TMT可以通過(guò)下調(diào)結(jié)腸CGRP含量從而調(diào)節(jié)PI?IBS內(nèi)臟敏感性。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)家族中的一員，在中樞有致痛和致敏感性作用。研究發(fā)現(xiàn)，適量的內(nèi)源性BDNF可維持感覺(jué)神經(jīng)及其神經(jīng)通路的正常功能，其異常升高可引起內(nèi)臟疼痛及其高敏感性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PI?IBS模型組大鼠海馬BDNF表達(dá)明顯升高，廣藿香干預(yù)后可下調(diào)模型組大鼠海馬BDNF表達(dá)，從而改善PI?IBS的相關(guān)癥狀。

綜上所述，廣藿香提取物可以有效調(diào)控感染后腸易激綜合征的模型大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，能顯著改善大鼠直腸擴(kuò)張?zhí)弁撮撝?；廣藿香對(duì)感染后腸易激綜合征模型大鼠內(nèi)臟高敏感性的調(diào)控作用可能與5?HT信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)。