邢威，陳雁雁，王樹人，王艷麗，王文姌，張洪財，孫秋

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江護理高等專科學校，黑龍江哈爾濱150301；3.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱150040）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加、易骨折為特征的全身性骨骼疾病，重癥患者會導(dǎo)致死亡，嚴重危害人們的身心健康，給社會造成極大的負擔[1?3]。目前單純的西藥防治骨質(zhì)疏松癥尚存在各種不良反應(yīng)。中醫(yī)學有獨特的見解，認為腎虛是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要病機，腎藏精，主骨生髓，以補腎壯骨為主要治法已達成普遍共識[4?5]。作者根據(jù)臨床經(jīng)驗自擬杜仲健骨方，方解：杜仲、淫羊藿補腎壯陽、強筋骨，腎陽推動精血運行，共為君藥。補骨脂、懷牛膝均能補腎助陽、強筋骨，以助君藥增強療效，共為臣藥。諸藥合用，使精血得補，筋骨得健。全方立法周全,組方嚴謹，共奏補益精血、填髓健骨之功效。

選擇2017年1月至2018年6月黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院骨科的106例骨質(zhì)疏松癥患者為研究對象，比較杜仲健骨方治療前后相關(guān)評分、骨密度和骨代謝指標的變化情況。治療后，其有效率為89.62%，骨密度值和骨代謝指標均優(yōu)于治療前，在臨床治療中取得較好療效，但該方劑治療骨質(zhì)疏松癥作用機制尚不清晰。前期研究[6]發(fā)現(xiàn)杜仲健骨方作用于Wnt/β?catenin信號通路發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

基于上述研究基礎(chǔ)，本實驗選取信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸肌醇3?激酶(phosphatidyl?inositol 3?kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、糖原合成酶激酶?3(glycogen synthasekinase 3β，GSK?3β)為指標，繼續(xù)探討杜仲健骨方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD清潔級雌性大鼠60只,體質(zhì)量（180±20）g，生產(chǎn)許可證號:SCXK（黑）2013?004，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心提供。

1.2 藥材及試劑

杜仲健骨方組成：杜仲、淫羊藿、補骨脂、懷牛膝；藥材購自哈藥集團哈爾濱世一堂中藥飲片有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院生藥學教研室孫慧峰教授鑒定為正品；取飲片杜仲35 g、淫羊藿25 g、補骨脂15 g、懷牛膝15 g，全方水煎煮1 h，煎煮3次，合并提取液，濃縮凍干，出膏率21%。白介素?1β（批號：1901205）、腫瘤壞死因子α試劑盒（批號：1903179）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20181024）、丙二醛（MDA，批號：20181216）（上海晶抗生物工程有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（Str ACP）試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司，批號：201901）；RNA總提取試劑盒（北京百泰克生物科技有限公司，批號：195637）；第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（天津為科生物科技有限公司，批號：18062）；引物基因合成（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所）；β?actin、PI3K、AKT、GSK?3β一抗（美國Thermo公司）。

1.3 主要儀器

ME103電子天平（d=1 mg，上海諾科儀器儀表有限公司）；ZX?S22數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司）；165?8001 Western blot電泳槽、垂直電泳系統(tǒng)（美國Thermo公司）；CFX96 RT?PCR儀、Varioskan LUX多功能酶標儀（美國Bio?Rad公司）；DCS?EXV600雙能骨密度儀（日本日立公司）；KDC?160HR型高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司，半徑=10 cm）。

1.4 制備模型、分組及給藥

50只大鼠參照文獻[7?9]方法制備模型，全部動物按照300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉。碘伏消毒后，沿后正中線切開皮膚，于肋弓下脊柱旁開處切開肌肉，打開后腹膜。找到位于腎臟后下方的卵巢，提出并分離周圍脂肪組織，結(jié)扎雙側(cè)卵巢下方的輸卵管、血管。切除雙側(cè)卵巢，縫合，在每側(cè)手術(shù)部位注射青霉素5萬u/只,連續(xù)3 d。另取10只為空白對照組，按照上述相同方法只翻動兩側(cè)卵巢，不作其他處理。術(shù)后4周，隨機選5只大鼠，取右側(cè)股骨，采用雙能X射線骨密度儀進行檢測，以驗證造模是否成功，經(jīng)檢測模型組造模成功率100%。采用隨機數(shù)字表法分為杜仲健骨方高（4.86 g/kg）、中（2.43 g/kg）、低劑量組（1.215 g/kg）、阿侖膦酸鈉組（陽性藥，1 mg/kg）、模型組（生理鹽水），每組10只大鼠，造模成功后，開始連續(xù)灌胃給藥8周。

1.5 骨密度檢測

應(yīng)用骨密度儀測定大鼠股骨的骨密度（BMD），儀器附帶軟件計算骨密度。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清指標

ELISA測定血清Str ACP、TNF?α、IL?1β、MDA含量及SOD活性。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT?PCR）

檢測酸肌醇3?激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶?3(GSK?3β)、磷酸化AKT的第308位酪氨酸[AKT(Thr308)]mRNA表達。

從低溫冰箱中（?80℃）取出大鼠右下股骨組織100 mg，剪碎，液氮速凍后，反復(fù)研磨，按Trizol試劑盒方法提取總RNA，按DNA Eraser試劑盒操作定量后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入引物進行DNA擴增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，70℃退火20 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次。在循環(huán)反應(yīng)后，按以下條件測溶解曲線。90℃20 s，50℃1 min，95℃20 s。在50℃升溫至95℃過程中，每升高0.5℃采集1次熒光信號，β?actin為內(nèi)參，所用引物均委托中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。數(shù)據(jù)采用PCR相對擴增分析方法進行統(tǒng)計，每組重復(fù)3次?；蛞镆姳?。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 蛋白免疫印跡法（Western blot）法檢測骨組織PI3K、AKT、GSK?3β蛋白表達

取大鼠肢股骨部分100 mg，用液氮冷凍骨組織并研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管，加入細胞裂解液和磷酸酶抑制劑，充分裂解骨組織，12 000 r/min離心15 min，取上清液總蛋白，測定蛋白濃度并定量，取40μg蛋白進行SDS凝膠電泳，半干法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫條件下脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，曝光，顯影，掃描圖片，軟件測定灰度值，每組重復(fù)3次，計算條帶吸光度值。

表2 各組大鼠骨密度結(jié)果Table 2 Results of bone mineral density of rats in each group（n=10）

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0分析，實驗數(shù)據(jù)用表示，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢測結(jié)果

見表2。與空白組比較，模型組骨密度明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，杜仲健骨方劑量組、陽性藥組骨密度值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），杜仲健骨方高劑量組與低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 ELISA測定各組血清指標結(jié)果

與 空 白 組 比 較，模 型 組StrACP、TNF?α、IL?1β、MDA顯著升高（P＜0.01），SOD活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組、杜仲健骨方劑量組TNF?α含量顯著降低、SOD活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、杜仲健骨方中、高劑量組IL?1β、StrACP、MDA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組血清TNF?α、IL?1β、StrACP、SOD、MDA含量結(jié)果Table3 ContentsofserumTNF?α,IL?1β,STRACP,SODandMDAineachgroup（n=10）

2.3 各組對信號通路PI3K/AKT/GSK?3βmRNA表達的影響

模型組PI3K、AKTmRNA表達低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組GSK?3βmRNA表達高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；陽性藥組、杜仲健骨方各劑量組PI3KmRNA表達高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。陽性藥組、杜仲健骨方中、高劑量組AKTmRNA表達高于模型組、GSK?3βmRNA低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組PI3K、AKT、GSK?3βmRNA表達結(jié)果Table4ExpressionofPI3K,AKTandGSK?3βmRNA（n=10）

表5 各組PI3K、AKT、GSK?3β蛋白表達結(jié)果Table5 ExpressionofPI3K,AKTandGSK?3βprotein（n=10）

2.4 各組對信號通路PI3K/AKT/GSK?3β蛋白表達的影響

模型組PI3K、AKT蛋白表達低于空白組，GSK?3β蛋白表達高于空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；陽性藥組、杜仲健骨方中、高劑量組PI3K、AKT蛋白表達高于模型組，GSK?3β蛋白表達低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

AKT的磷酸化（308位點）[p?AKT cThr 308]水平變化顯著，與空白組比較，模型組中AKT的磷酸化水平明顯降低（P＜0.01），杜仲健骨方組給藥后AKT磷酸化水平逐漸升高，呈現(xiàn)出劑量依賴性，與模型組比較，中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。見圖1，表5。

圖1 骨組織PI3K、AKT、GSK?3β蛋白表達Figure 1 Expression of PI3K,AKT and GSK?3βprotein in bone tissue

3 討論

中醫(yī)學認為骨質(zhì)疏松癥的主要病機為腎精虧虛、腎陽不足，腎虛是其根本原因[10?11]。中藥治療療效明確且副作用較少，受到人們的青睞。本實驗結(jié)果證實杜仲健骨方能夠有效治療骨質(zhì)疏松癥。TNF?α與IL?1β具有多種生物效應(yīng)的細胞炎癥因子，研究表明[12?13]兩者與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，可能通過誘導(dǎo)巨噬細胞集落刺激因子（M?CSF）和RANKL的表達刺激破骨細胞形成和骨吸收。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組比較，杜仲健骨方劑量組中TNF?α含量顯著降低；杜仲健骨方中、高劑量組中IL?1β含量顯著降低，說明該方劑可減輕骨質(zhì)疏松的炎癥反應(yīng)，并且呈劑量依賴性。SOD與MDA是反映機體自由基的清除能力及氧化應(yīng)激的損傷程度的重要指標，氧化應(yīng)激抑制Wnt通路可激活Fox O通路，引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組比較，杜仲健骨方劑量組中SOD活性顯著升高，杜仲健骨方中、高劑量組MDA含量顯著降低，說明該方劑可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷，并且呈劑量依賴性。Str ACP主要存在于破骨細胞中，其血清含量的高低可反映破骨細胞骨吸收的活躍程度。與模型組比較，杜仲健骨方中、高劑量組Str ACP含量顯著降低。表明該方劑能夠抑制骨吸收。

杜仲健骨方通過促骨形成的作用治療骨質(zhì)疏松癥，這種成骨作用是否與促進細胞增殖有關(guān)尚不明確。PI3K/Akt信號通路是細胞增殖、轉(zhuǎn)移、黏附和死亡過程的重要調(diào)節(jié)者。在正常生理條件下，PI3K/Akt信號通路可選擇性地影響成骨細胞和破骨細胞的生理功能，對維持骨組織動態(tài)平衡具有重要作用[15?16]。PI3K激活后，作為PI3K下游的靶點蛋白，可以使磷肌醇類因子發(fā)生磷酸化，特別是磷酸化AKT的第308位酪氨酸從而激活A(yù)KT，是其該蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)樞紐[17]。GSK?3β能夠被多種信號通路調(diào)節(jié)，影響細胞存活，PI3K/Akt是其中最重要的上游調(diào)節(jié)通路[18?23]。AKT可使GSK?3β第9位絲氨酸磷酸化，降低GSK?3β的磷酸化水平，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲健骨方能夠上調(diào)PI3K的表達水平和AKT的磷酸化水平，并且下調(diào)GSK?3β的表達水平，說明該方劑可以調(diào)控PI3K/AKT/GSK?3β信號通路。杜仲健骨方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制，可能與調(diào)控PI3K/AKT/GSK?3β信號通路有關(guān)，具體作用機制還需深入研究。