陳素雯，魏嘉寶，邱思娃，李苑新，蔡延渠，吳燕紅

（1.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東廣州510006；2.高州中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東高州525200）

龍脷葉是嶺南民間傳統(tǒng)常用止咳平喘中藥，始載于《嶺南采藥錄》，其中所記載的龍脷葉“治痰火咳嗽，以其葉煮豬肉湯食之”[1]。臨床上龍脷葉常用于治療“支氣管炎、支氣管哮喘、肺結(jié)核咳嗽”等呼吸道疾病[2-3]，近年來，對龍脷葉的藥理研究報(bào)道主要涉及抗炎及止咳作用，對平喘作用的研究較少。本研究采用大鼠哮喘模型，觀察龍脷葉水提取物對哮喘大鼠支氣管及肺組織的病理學(xué)及血清中IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α的影響，初步探討龍利葉平喘的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量140～160 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號:SCXK（粵）2018?0002，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，使用許可證號:SYXK（粵）2017?0125。

1.2 藥物

龍脷葉水提取物制備：龍脷葉（批號180801，符合2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，廣東時珍制藥有限公司），剪碎，大小約為2 cm×2 cm，加10倍量水煎煮1 h，煎煮2次，醫(yī)用棉花過濾，合并濾液，濃縮至每毫升相當(dāng)于生藥量1 g（1 g/mL）。地塞米松注射液（2 mg/mL，批號1704292，江蘇漣水制藥有限公司）;0.9%NaCl注射液（批號H18060814，山東華魯制藥有限公司）;烏拉坦（批號Z30S9Y71673，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 試劑

卵清白蛋白（OVA）（批號1031K051，北京Solar?bio公司）;氫氧化鋁凝膠（批號O1004A，大連美侖生物技術(shù)有限公司）;IL?5和TXB2 ELISA試劑盒（批號分別為：L190109529、L181211238，武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司）;6?Keto?PGF1αELISA試劑盒（批號：TY3CXHLYC6，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）;無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;蘇木素?伊紅染液（G1005，武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.4 主要儀器

霧化箱（自制，30 cm×19 cm×17 cm）；WH?802超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；Neo?fuge 15R臺式高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；MX?F渦旋混合器（武漢塞維爾生物科技有限公司）；DW?86L626超低溫冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；RT3100自動洗板機(jī)（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Epoch酶標(biāo)檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）；JJ?12J脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；JB?P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；JB?L5凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；KD?P組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Corporation）；Nikon DS?U3成像系統(tǒng)（Nikon Corporation）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

40只大鼠隨機(jī)分為正常組（N組）、模型組（Mo組）、龍脷葉水提取物高劑量組（H組）、龍脷葉水提取物低劑量組（L組）、地塞米松組（De組），每組8只（雌性4只，雄性4只，分組分性別分籠飼養(yǎng)），實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2.2 哮喘模型建立

參考文獻(xiàn)［4?5］制備大鼠哮喘模型：除正常組外，其余各組于實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射含OVA 100 mg與100 mg氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液1 mL，致敏大鼠，正常組以生理鹽水代替OVA腹腔注射，第15天開始將大鼠置于自制的透明密閉霧化箱，以2%OVA生理鹽水溶液最大量超聲霧化吸入激發(fā)，每次30 min，連續(xù)激發(fā)14 d，正常組以生理鹽水代替OVA超聲霧化吸入。除正常組外大鼠腹腔注射OVA后即出現(xiàn)精神萎靡、拱背蜷縮等表現(xiàn)。在霧化激發(fā)后前5～10 min出現(xiàn)躁動不安、搔抓鼻子皮毛等癥狀，10 min后活動明顯減少、毛發(fā)豎立、俯臥不動、伸頸等表現(xiàn)為模型建立成功。

2.3 給藥方法

從第15天起于每次激發(fā)前1 h灌胃給藥，N組與Mo組灌服注射用生理鹽水1 mL/100 g；De組灌服地塞米松注射液0.5 mg/kg；根據(jù)《中國藥典》規(guī)定用量9～15 g，按徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中不同實(shí)驗(yàn)動物與人的等效劑量比值來計(jì)算實(shí)驗(yàn)用藥劑量，即H、L組灌服龍脷葉水提取物劑量分別為5.4 g/kg與1.35 g/kg；每天1次，連續(xù)14 d。

2.4 標(biāo)本采集

2.4.1 血清樣本采集 末次給藥霧化吸入OVA激發(fā)哮喘后24 h內(nèi)，各組大鼠分別給予20%的烏拉坦生理鹽水溶液（劑量0.8 g/kg）腹腔注射麻醉，眼眶內(nèi)靜脈取血3～5 mL，3 500 r/min離心15 min，吸取血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 肺組織樣本采集 大鼠取血后迅速剖取肺臟。取左側(cè)肺臟組織固定于4%(φ)多聚甲醛24 h以上。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 肺組織病理學(xué)觀察 將固定后的組織逐級酒精脫水、包埋、切片，HE染色法，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察支氣管與肺組織的病理變化，比較各組大鼠支氣管與肺組織病理學(xué)變化。

2.5.2 血清IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α含量檢測 將保存于-80℃血清進(jìn)行解凍處理，按ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α檢測。

2.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組樣本間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肺組織病理學(xué)觀察

肺組織HE染色結(jié)果顯示,N組：支氣管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密（A），局部可見細(xì)支氣管(B)管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭）；組織中可見較多肺泡壁輕度增厚，并伴有少量淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(C)（紅色箭頭）。如圖1。

Mo組：多見支氣管管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞(A)（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭），局部支氣管管腔內(nèi)可見較多紅細(xì)胞（藍(lán)色箭頭）；多見血管周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤成環(huán)，形成血管套袖（紅色箭頭）；多見支氣管、血管周圍與肺泡組織內(nèi)有較多巨噬細(xì)胞浸潤(B)（綠色箭頭），多見肺泡壁增厚，并伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(C)（紅色箭頭）。如圖2。

De組：支氣管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密（A），局部細(xì)支氣管管腔內(nèi)有少量嗜酸性黏液分泌（黑色箭頭），局部管腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細(xì)胞（黃色箭頭）及少量紅細(xì)胞（藍(lán)色箭頭）；血管周圍“套袖”樣炎性浸潤消失，多見支氣管與血管周圍肺泡腔中有較多巨噬細(xì)胞浸潤（紅色箭頭）；多見肺泡壁增厚，伴有較多淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤（綠色箭頭）。如圖3。

H組：局部可見支氣管管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭），局部支氣管管腔內(nèi)可見少量紅細(xì)胞；血管周圍“套袖”樣炎性浸潤明顯減少或消失，局部可見血管或氣管周圍肺泡腔中有較多巨噬細(xì)胞浸潤（藍(lán)色箭頭）；多見肺泡壁增厚，局部有較多炎性細(xì)胞浸潤（紅色箭頭）。如圖4。

L組：局部可見支氣管管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞（黑色箭頭）及少量嗜酸性黏液分泌（黃色箭頭）；血管周圍“套袖”樣炎性浸潤明顯減少或消失，局部可見血管或氣管周圍肺泡腔中有較多巨噬細(xì)胞浸潤（綠色箭頭）；組織中可見大量肺泡壁增厚，并伴有較多淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤（紅色箭頭）；局部可見肺泡腔內(nèi)有少量嗜酸性物質(zhì)（藍(lán)色箭頭）。如圖5。

圖1 正常對照組肺組織染色結(jié)果(200×)Figure 1 Histopathology of lung tissues in the normal group(200×)

觀察圖1～圖5中各實(shí)驗(yàn)組的肺組織染色結(jié)果可知，與N組相比，M組支氣管管腔內(nèi)有部分上皮細(xì)胞脫落，支氣管、血管周圍和肺泡組織炎性細(xì)胞明顯增多，且在血管周圍形成明顯的“套袖”環(huán)，哮喘病變樣改變明顯，表明實(shí)驗(yàn)造模成功。與M組相比，De、H、L組中巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞均有明顯減少，血管周圍“套袖”樣炎性浸潤明顯減少或消失，表明治療組能有效改善哮喘大鼠的肺組織和支氣管病變。

圖2 哮喘模型組肺組織染色結(jié)果(200×)Figure 2 Histopathology of lung tissues in the model group(200×)

圖3 地塞米松組肺組織染色結(jié)果(200×)Figure 3 Histopathology of lung tissues in the dexamethasone group(200×)

圖4 龍脷葉高劑量組肺組織染色結(jié)果（200×）Figure 4 Histopathology of lung tissues in the high dose of Sauropus spatulifolius group(200×)

3.2 大鼠血清中IL?5、TXB2和6?Keto?PGF1α濃度水平

與正常組比較，模型組IL?5和TXB2濃度水平顯著升高(P＜0.01)，而6?Keto?PGF1α濃度水平顯著降低(P＜0.01)，TXB2/6?Keto?PGF1α比值顯著升高(P＜0.01);地塞米松組、龍脷葉水提取物高劑量、低劑量組分別與模型組相比，IL?5和TXB2濃度水平顯著降低(P＜0.01)，而6?Keto?PGF1α濃度水平顯著升高(P＜0.01，P＜0.05）；TXB2/6?Keto?PGF1α比值顯著降低(P＜0.01)。見表1。

圖5 龍脷葉低劑量組肺組織染色結(jié)果（200×）Figure 5 Histopathology of lung tissues in the low dose of Sauropusspatulifolius group(200×)

表1 各組大鼠血清中炎性因子水平比較Table 1 Comparison of inflammatory factors in serum of rats in each group(x±s,n=8)

4 討論

哮喘是呼吸道常見疾病，通常認(rèn)為哮喘是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥。IL?5是由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可刺激嗜酸性粒細(xì)胞生長和分化，主要表現(xiàn)為對嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)募集、遷移入呼吸道并維持炎癥反應(yīng)具有正向調(diào)控作用,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和IL?5表達(dá)水平增高是哮喘支氣管黏膜的特征性改變[6]。研究表明,IL?5是哮喘炎癥中的主要調(diào)節(jié)因子[7?8]。

血栓素A2（TXA2）和前列腺素I2（PGI2）的比例失衡在哮喘發(fā)病中的作用，已越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[9?10]。TXA2可促使血小板聚集，氣道平滑肌收縮，還可促使氣道分泌物增多，血管滲透性增高，從而加重氣道的炎癥反應(yīng)，而PGI2的作用幾乎與TXA2的作用相反。因此，TXA2增高或PGI2下調(diào)，致TXA2/PGI2比例失衡或增高引起支氣管平滑肌收縮而導(dǎo)致哮喘[11?13]。TXA2和PGI2在體內(nèi)水解為活性很小但更穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和6?ket?PGF1α，常 以TXB2和6?ket?PGF1α作 為 觀 察TXA2和PGI2活性的標(biāo)志物。因此，血清TXB2和6?ket?PGF1α水平可作為衡量TXA2和PGI2平衡的標(biāo)志物[14?16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示龍脷葉提取物能降低哮喘大鼠血清中IL?5、TXB2濃度水平和TXB2/6?ket?PGF1α比值，顯著升高6?keto?PGF1α濃度水平，提示龍脷葉水提取物可能通過降低炎性細(xì)胞濃度水平從而減輕哮喘模型大鼠肺組織與氣管的炎性病理改變,促進(jìn)哮喘大鼠肺功能的恢復(fù)。但在治療組（地塞米松組、龍脷葉提取物高劑量、低劑量組）的病理切片中氣管與肺泡組織周圍仍可觀察到較多的巨噬細(xì)胞與炎性細(xì)胞，這種情況有待進(jìn)一步探討。后續(xù)可進(jìn)行更深入的血清化學(xué)研究，結(jié)合高效液相法和質(zhì)譜分析法檢測鑒定有效成分，將有助于闡明其發(fā)揮哮喘作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。