魏丹，蔣贛，伍春嫻

（廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）被稱為“蛋白之王”，是從牛奶中提取的一種蛋白質(zhì)，具有營養(yǎng)價值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點，其生物學(xué)價值和臨床價值較高，在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景[1?3]。因此，近年來許多專家學(xué)者開展了對WPI的研究，尤其是對其團聚和凝膠行為及相應(yīng)團聚體和凝膠結(jié)構(gòu)的研究[4?5]。

過去，WPI用于食物和醫(yī)藥領(lǐng)域的時候，都是首先將WPI加入到食物或者藥物中，然后將混合物加熱到至少65℃形成濃度較高的溶液或凝膠[5?7]，這樣很容易破壞食物和藥物的性質(zhì)。于是冷固團聚和凝膠技術(shù)應(yīng)運而生，這種技術(shù)將WPI加入到食物和藥物中的方法分為兩步：第一步將WPI熱變性得到WPI初 級 團 聚 體（WPI?PreA，Why Protein Isolate Pre?aggregate）膠體分散體；第二步再將WPI?PreA膠體分散體和食物或藥物一起在室溫下用電解質(zhì)（Ca?Cl2，NaCl等）誘導(dǎo)團聚和凝膠[8?9]。目前，文獻報道的大多數(shù)研究集中于第一步，兩步結(jié)合起來研究以及對第二步團聚過程的動力學(xué)研究比較少。本研究采用光散射方法將兩步研究結(jié)合起來，第一步對WPI熱 變 性 得 到WPI?PreA，用 廣 角 光 散 射 儀（WALS，Wide Angle Light Scattering）的動態(tài)光散射（DLS，Dynamic Light Scattering）和 靜 態(tài) 光 散 射（SLS，Static Light Scattering）方法測量WPI?PreA的一系列重要參數(shù)；第二步采用電解質(zhì)CaCl2溶液對WPI?PreA誘導(dǎo)團聚，首先得到其臨界聚沉濃度（C CC，Critical Coagulation Concentration），然后選取遠離C CC的1個CaCl2溶液濃度，用小角光散射儀（SALS，Small Angle Light Scattering）研究其在慢速團聚（RLCA，Reaction Limited Cluster Aggregation）條件下的團動力學(xué)和團聚體結(jié)構(gòu)，同時引入了電子顯微鏡（EM，Electron Microscopy）的取像成像顯微技術(shù)驗證得到的團聚體結(jié)構(gòu)的可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

針頭式過濾器（25 mm GD/X，濾紙孔徑0.45 mm，英國Whatman公司）；電子顯微鏡（FEI Quanta 600 ESEM，美國），檢測系統(tǒng)：取向成像顯微術(shù)（OIM），EDX能譜分析，特點：LaB6發(fā)射極，高壓1～40 kV；廣角光散射儀，BI?200SM角度測量器（美國Brookhaven Instruments）配以Ventus LP532型激光發(fā)射器（英國Laser Quantum），入射光波長為λ1=532 nm，測角范圍20～145°；Mastersizer 2000小角光散射儀（英國Malvern），入射光波長為λ2=633 nm，測角范圍0.02～40°。

1.2 試劑

WPI粉末（BiPro，JE345?3?420，Davisco Foods In?ternational Inc.，美國明尼蘇達）；疊氮化鈉（NaN3，分析純）、NaOH（固體，分析純）、HCl溶液（0.1 mol/L，分析純）、4?羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（HEPES，分析純）均由Sigma?Aldrich公司提供。超純水，自制。

2 方法

2.1 WPI?PreA的制備及性質(zhì)測定

將WPI粉末溶解于超純水（后面所有溶液的配置均用超純水）中，并用NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，配制成WPI濃度Cp=100 g/L的溶液后加熱到90℃保持30 min使全部變性，然后趁熱用針頭式過濾器將溶液過濾除掉溶液中可能存在的大團聚體。變性后得到的WPI?PreA溶液進一步用含有NaN3（作用是避免細菌滋生）的超純水稀釋至Cp=50 g/L的膠體分散體（最終NaN3的濃度為5×10-3mol/L），儲存于溫度為4℃左右的冰箱中，備用。按照文獻[10]方法采用DLS和SLS方法測量初級粒子在不同濃度的旋轉(zhuǎn)半徑R g,0和Rh,0。

2.2 臨界聚沉濃度的測量

臨界聚沉濃度（C C C，Critical Coagulant Concen?tration）是指在一定時間內(nèi)，使一定量的溶膠發(fā)生明顯的聚沉所需電解質(zhì)的最小濃度。將一定數(shù)量的分散體滴加到不同濃度的電解質(zhì)溶液中，設(shè)定膠粒的體積分數(shù)為φ=5×10-2時，肉眼觀察是否有絮狀凝膠物出現(xiàn)，絮狀凝聚物馬上出現(xiàn)時電解質(zhì)的最小濃度即為該膠體的臨界聚沉值。需要說明的是，雖然以上測試聚沉值的方法為經(jīng)驗方法，但因為膠體的穩(wěn)定性對離子的強度變化極其敏感，特別是膠粒與分散介質(zhì)的顏色差別較大時，聚沉值的誤差在10%以下[8,11]。測得本體系WPI?PreA在CaCl2誘導(dǎo)下的C CC值為26 mmol/L。

2.3 CaCl2誘導(dǎo)的RLCA團聚實驗及測量

為了保證團聚實驗在RLCA條件下進行，選取遠離C C C的CaCl2濃度Cs=10 mmol/L，膠粒體積濃度C p=2.00 g/L。實驗開始前，先用超純水對WPI?PreA膠體分散體和CaCl2溶液進行多次稀釋，以免膠體溶液和電解質(zhì)溶液濃度太高導(dǎo)致團聚實驗過程中局部混合不均而出現(xiàn)大團聚體。然后把稀釋的CaCl2溶液倒入膠體分散體中達到設(shè)定的電解質(zhì)濃度、膠粒濃度和設(shè)定的pH值7.00。平衡幾秒后，將溶液分成相等的兩部分，一部分用注射器迅速但輕輕地把團聚體系注入SALS測試槽，在線檢測膠粒的團聚動力學(xué)過程；另一部分置于與測試槽溫度相同的恒溫水槽中，待到團聚實驗結(jié)束時取出團聚體做EM測試。

3 結(jié)果與討論

3.1 WPI?PreA表征結(jié)果

由Zimm?plot[12]方法可知膠粒的重均分子量Mw和第二維里系數(shù)A存在如下關(guān)系：

其中,Cp是WPI的濃度，g/cm3；K是光學(xué)常數(shù):

其中，n0是溶劑水的折光指數(shù)（1.33）；d n/d C p是WPI溶液的折光指數(shù)增量，根據(jù)文獻[13]及WPI成分組成計算值為0.190 cm3/g；N A是阿伏伽德羅常數(shù)（6.02×1023）；方程(1)中的R e x(θ)是膠粒在角度θ的超瑞利比，它與相同角度下甲苯的超瑞利比R T（Wu等測得在入射光波長范圍為420～700 nm時，其值為2.13×10-5cm-1）之間的關(guān)系為：

其中，Iex(θ)是所測膠體在角度θ的光散射強度；IT是甲苯在與所測膠體相同測試條件下的光散射強度，nT是甲苯的折光指數(shù)，取1.496。

圖1中的圓點曲線是用SLS方法得到的K Cp/Rex(0)與WPI濃度Cp之間的關(guān)系，二者基本呈直線關(guān)系，用方程(1)由直線斜率和截距可以得到WPI?PreA的重均分子量Mw和第二維里系數(shù)A2的值，見表1。可見，A2的值是正值，表明WPI?PreA之間的相互作用力是排斥力，這與蛋白質(zhì)表面含有羧基有關(guān)，其pKa～4.75，本體系pH為7.00，羧基基本處于電離狀態(tài)帶負電，分子與分子之間的羧基間存在排斥力，因此，置于冰箱中并且含有5×10-3mol/L的NaN3的WPI?PreA可以保存數(shù)月之久。WPI的分子量為6.06×104g/mol，從Mw值可以算出WPI?PreA的聚集度Nagg為91.82，見表1。

用SLS和DLS方法測得的不同C p下WPI?PreA的旋轉(zhuǎn)半徑Rg,0和水力學(xué)半徑Rh,0見圖1所示?？梢?，Rh,0的平均值為29.32 nm，與C p基本無關(guān)，而R g,0的平均值為70.54 nm，是Rh,0的2.50倍，且其值隨Cp的增加有些許減小。這主要是由R g,0和Rh,0的定義及初級團聚體的結(jié)構(gòu)決定的，Rg,0是根據(jù)膠粒分子上各個點到其質(zhì)量中心的平均距離計算的，而Rh,0是指與所測膠粒具有相同擴散系數(shù)的球形膠粒的半徑，所以Rg,0與膠粒形狀密切相關(guān)，其值隨Cp減小，說明其外部無規(guī)則延展開的鏈因為濃度增加導(dǎo)致膠粒之間相互碰撞幾率增加而受到阻礙，Rg,0的平均值為Rh,0的2.50倍主要也是由于WPI變性時形成的延展開的長纖維狀結(jié)構(gòu)所致[14?15]。

表1 初級團聚體WPI?PreA相關(guān)參數(shù)的測定結(jié)果Table 1 Parameters of the prepared WPI pre?aggregates(WPI?PreA)

圖1 KCp/R ex(0)、WPI?PreA旋轉(zhuǎn)半徑R g,0和水力學(xué)半徑Rh,0與WPI濃度C p的關(guān)系Figure 1 The relationship between the quantity,KC p/R ex(0),the radius of gyration,R g,0,and the hydrodynamic radius,R h,0,of the WPI?PreA,and the WPI concentration,Cp

3.2 RLCA條件下WPI?Pre A的團聚動力學(xué)和團聚體結(jié)構(gòu)

WPI?Pr e A的團聚在室溫下進行，濃度固定在C p=2.00 g/L。SALA所測得的團聚體的光散射強度I(q)的表達式如下[10,16]：

其中，I(0)是q=0的散射強度，P(q)是初級團聚體WPI?Pre A的形狀因子，它由直接測量濃度為2.00 g/L的WPI?Pr e A分散體得到，〈S(q)〉是電解質(zhì)誘導(dǎo)團聚得到的團聚體的歸一化形狀因子，對初級團聚體可以認為〈S(q)〉=1。q是基于散射角q計算得到的波矢量：

團聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈R g〉*和分形維數(shù)D f，可以從〈S(q)〉得到[10,17]：

由方程(6)和(7)得到的平均旋轉(zhuǎn)半徑只有在團聚體足夠大時才正確，對小團聚體，比如在團聚初始階段生成的團聚體，初級團聚體對旋轉(zhuǎn)半徑的貢獻需要考慮進來：

其中，R g,0的值見表1所示。

此外，分形維數(shù)Df還可以由q=0處的光散射強度I(0)求得[8,18]：

膠粒團聚過程中團聚體質(zhì)量分布可以用PBE模型來表述[8,15,18]：

其中N i(t)是質(zhì)量為i的團聚體在時間t的質(zhì)量濃度，K i,j是質(zhì)量為i和j的兩個團聚體之間的團聚速率常數(shù)，它的定義如下：

其中，KB=8kT/3μ是Smoluchoeski速率常數(shù)（k是波爾茲曼常數(shù)，1.381×10-23J/K，T和μ分別是分散體的溫度和動力學(xué)黏度，單位分別為K和Pa·s）；W是Fuchs穩(wěn)定性常數(shù)，典型RLCA團聚過程其值大于5，一般小角光散射適合測得的值在103～107數(shù)量級的范圍；乘積項(ij)λ表示在RLCA團聚過程中，團聚體的反應(yīng)速率隨團聚體質(zhì)量的增加而增大，指數(shù)λ的值理論上一般是0.50左右[10,15,19?20]。這個模型的解能給出整個團聚過程中不斷長大的所有團聚體的質(zhì)量分布（Ni，i=1,2，……），從Ni可以計算出團聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈R g〉的值：

其中，Rg,i是質(zhì)量為i的單個團聚體的旋轉(zhuǎn)半徑，RLCA條件下，無融合膠粒團聚體的分形維數(shù)D f值的范圍為2.00～2.10，可以通過上述團聚體平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉和q=0處光散射強度I(0)等得到，可以作為一個已知參數(shù)，所以通過公式(10)、(11)和(12)擬合膠粒的團聚動力學(xué)就只有W和λ兩個擬合參數(shù)，盡管體系中有兩個擬合參數(shù)，但W只對〈R g〉的初始值敏感，而λ對團聚過程后期的〈Rg〉值敏感。

圖2是用SALS測得的團聚體的散射強度隨時間的演化曲線，分為兩個不同的時間間隔展示于(A)（團聚初期）和(B)圖（團聚中后期），從圖(A)可以看到早期的團聚時間t=20.60 min時，I(q)的值在大q值處（q=1×10-3）有一個彎曲，其彎曲位置隨著時間不斷上揚且移向小q值處（q＜1×10-3），在q＞1×10-3部分曲線不重疊，說明團聚初期是由WPI?PreA初級團聚體或微觀結(jié)構(gòu)團聚體不斷結(jié)合長大的過程。團聚中后期圖(B)中I(q)的值在q＜1×10-3部分依然隨著時間向上增長，而在q＞1×10-3部分，曲線重疊在一起基本與時間無關(guān)，這表明微觀結(jié)構(gòu)的變化已經(jīng)結(jié)束，這些微觀結(jié)構(gòu)團聚體開始連接在一起形成宏觀結(jié)構(gòu)，即凝膠。I(q)的值隨著團聚過程的進行顯著增大，表明團聚體隨著團聚的進行逐漸長大，這種緩慢、漸進的團聚體增長表明WPI?PreA的團聚是在RLCA條件下進行的，I(q)曲線上的冪指數(shù)區(qū)域跨越兩個數(shù)量級且其斜率值為-2.10，是典型的RLCA條件下得到的團聚體的分形維數(shù)的值。

圖2 WPI?PreA團聚過程中的團聚體的光散射強度I(q)曲線隨時間的演化曲線Figure 2 Typical time evolution of the scattered intensity curves I(q)to the aggregation of the WPI?PreA

將不同時間團聚體的歸一化平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉對歸一化的波矢量q×〈R g〉作圖，如圖3所示，可以看到曲線全部重疊在一起，冪指數(shù)區(qū)域跨越兩個數(shù)量級，呈直線關(guān)系，直線的斜率為-2.10，說明WPI?PreA的團聚體的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出分形體特征，且在研究條件下的團聚過程屬于典型的RLCA團聚，分形維數(shù)D f=2.10。為了更進一步證明從I(q)和S(q)得到的Df值的正確性，用公式(9)計算了不同時間q=0處的散射光強度I(0)與〈R g〉/Rh,0之間關(guān)系，如圖4所示，可見除了團聚初始階段的兩個點（團聚初期會有稍許誤差），I(0)與〈R g〉/Rh,0的log?log對數(shù)關(guān)系圖基本呈直線，且直線斜率為2.11，進一步證明了WPI?PreA在RLCA條件下的團聚過程中形成團聚體的Df值確實是2.10左右。分形維數(shù)D f越小，所形成團聚體的結(jié)構(gòu)越疏松；反之，Df值越大，如D f的值為3.00左右，說明形成團聚體的結(jié)構(gòu)越緊密，纖維狀凝膠與含有低分形維數(shù)的團聚體的凝膠是相似的，根據(jù)所得到的D f的值認為團聚體的結(jié)構(gòu)呈纖維狀結(jié)構(gòu)[10]。取上述方法得到的Df=2.10，將W和入作為擬合參數(shù)，用PBE模型方程(10)、(11)和(12)對采用公式(6)和(8)計算得到的團聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈Rg〉隨時間t的變化曲線進行擬合，得到W和λ的值分別為1.10×106和0.45，如圖5所示，可見曲線擬合值和空心圓點實驗值能較好地吻合，證明了前面得到的D f值的可靠性。

圖3 圖2中不同時間的團聚體的歸一化平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉與歸一化的波矢量q×〈Rg〉的函數(shù)關(guān)系圖Fi gure 3 The normalized average structure factor of clusters,〈S(q)〉,at various aggregation times,as a function of normalized wavevector,q×〈R g〉corresponding to the ag?gregation system in Fig.2

為了更進一步驗證對團聚體結(jié)構(gòu)分析的可靠性，采用電鏡（EM）的取像成像技術(shù)對團聚實驗結(jié)束時的團聚體進行分析，結(jié)果見圖6。可見，團聚體呈絞成股狀的疏松的纖維狀結(jié)構(gòu)，驗證了光散射實驗結(jié)果的可靠性。

圖4 在q=0處的散射光強度I(0)與〈R g〉/Rh,0之間關(guān)系的時間演化曲線Figur e 4 Time evolution of the intensity at q=0,I(0),as a function of the corresponding〈R g〉/Rh,0

圖5 〈Rg〉隨時間t的變化規(guī)律的PBE擬合結(jié)果（實線曲線）與實驗結(jié)果（空點點線）的比較Figur e 5 PBE simulations(solid line)of the time evolutions of〈Rg〉compared with experiments(open symbol)

圖6 WPI?PreA團聚體的EM圖Fi gure 6 EM image of WPI?PreA clusters

4 結(jié)論

本文采用光散射方法研究乳清分離蛋白WPI熱變性得到的初級團聚體WPI?Pre的性質(zhì)及WPI?Pre在電解質(zhì)CaCl2誘導(dǎo)下在慢速團聚（RLCA）下的團聚動力學(xué)和團聚體結(jié)構(gòu)。得到的WPI?Pre的一系列重要參數(shù)：重均分子量Mw、第二維里系數(shù)A2、旋轉(zhuǎn)半徑Rg,0和水力學(xué)半徑Rh,0的值，說明初級膠粒分子之間存在排斥力且呈纖維狀結(jié)構(gòu)，這種分析方法能為蛋白質(zhì)的分析檢測提供一種比較可靠的方法。通過小角光散射研究分析認為團聚體呈疏松的纖維狀結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡的取像成像顯微術(shù)驗證了光散射測試結(jié)果的可靠性，對團聚體結(jié)構(gòu)的表征能為未來多孔材料、藥物緩釋膠囊等材料的制備提供參考依據(jù)和指導(dǎo)。