田甜，紀(jì)玉華，王壽富，陳丹燕，劉遠(yuǎn)俊，程學(xué)仁

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東佛山528244）

車前草是車前科植物車前Pl antago asiaticaL.或平車前Plantago depres saWilld.的干燥全草，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，性寒、味甘，歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，主要功效為清熱利尿通淋、祛痰、涼血、解毒[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，車前草具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、降血脂、降血尿酸等作用[3?6]。車前Planta go asi at i caL.主產(chǎn)于江西、四川、安徽、江蘇等地[7]，主要含有黃酮及其苷類、生物堿類、苯乙醇苷類、三帖類、甾醇類、多糖類、環(huán)烯醚萜類等化學(xué)成分[8?9]，其中黃酮類、苯乙醇苷成分是車前草的主要活性成分。目前,車前草的相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性、提取等方面，關(guān)于浸出物的研究未見報道。2020年版《中國藥典》一部車前草項下僅規(guī)定以熱浸法測定水溶性浸出物含量限度。本研究以全國4個主產(chǎn)地的車前草為研究對象，建立車前草浸出物特征圖譜，并測定浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征圖譜共有峰總面積及大車前苷、木犀草苷和車前草苷D 3個指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

層次分析法是一種定性和定量相結(jié)合的、層次化的分析方法，它通過數(shù)理運(yùn)算將人們主觀上對各項指標(biāo)的重視程度與各項指標(biāo)之間的相互聯(lián)系轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪炕臋?quán)重系數(shù)，實(shí)現(xiàn)主觀重要因素與問題的決策性分析[10?11]。熵權(quán)TOPSIS法是根據(jù)評價對象與理想化目標(biāo)的接近程度進(jìn)行順序優(yōu)選的一種多指標(biāo)決策分析方法，能夠客觀地反映各指標(biāo)的相對重要程度，提高指標(biāo)綜合評價結(jié)果的真實(shí)性和可靠性，但要求樣本數(shù)量盡可能多[12]。本研究結(jié)合層次分析法、熵權(quán)TOPSIS法優(yōu)選車前草浸出物的最佳測定方法，在一定程度上減少了主觀因素對問題決策的影響，也擴(kuò)大了熵權(quán)法的利用范圍[11,13?14]。此外，通過熵權(quán)TOPSIS法對不同產(chǎn)地車前草浸出物進(jìn)行綜合評價，以期進(jìn)一步完善車前草藥材的質(zhì)量控制，建立更加全面的車前草質(zhì)量評價方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

H?Class型沃特世液相色譜儀（沃特世儀器公司）；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平（梅特勒?托利多儀器有限公司）；HWS28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司）；Milli?Q?Di?rect超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）；KQ?700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG?9147A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

大車前苷（批號：111914?201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.2%）、木犀草苷（批號：111720?201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；車前草苷D對照品（批號：147331?98?4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙醇為分析純（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（默克股份有限公司），磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（Milli?Q Direct超純水）。

10批車前草藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定，均為車前科植物車前Plant a go asiaticaL.的干燥全草，具體見表1。

表1 車前草藥材樣品信息Table 1 Information of Plant ago asiatica L.samples

2 方法與結(jié)果

2.1 浸出物測定方法

2.1.1 冷浸法 稱取車前草藥材（S4）供試品適量，粉碎（過2號篩），取約4 g，精密稱定，分別置250 mL錐形瓶中，分別加水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇各100 mL（每種溶劑平行測定3份），稱定質(zhì)量，按2020年版《中國藥典》通則2201項下浸出物測定法中的冷浸法測定，依次計算浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

2.1.2 熱浸法 稱取車前草藥材（S4）供試品適量，粉碎（過2號篩），取約4 g，精密稱定，分別置250 mL錐形瓶中，分別加水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇各100 mL（每種溶劑平行測定3份），稱定質(zhì)量，按2020年版《中國藥典》通則2201項下浸出物測定法中的熱浸法測定，依次計算浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，熱浸法下，車前草浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于同水平下冷浸法，不同浸提溶劑浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)排序為水＞50%乙醇＞75%乙醇＞95%乙醇。

表2 不同浸提方法車前草浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 2 Determination of Plantain extract by different extrac?tion methods(n=3) w/%

2.2 車前草浸出物特征圖譜的建立及3種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；流動相：乙腈（A）?0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，12%～13%A；5～15 min，13%～17%A；15～20 min，17%A；20～25 min，17%～88%A；25～26 min，88%～12%A；26～35 min，12%A）；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣量：1μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取大車前苷、木犀草苷、車前草苷D對照品適量，精密稱定，加60%甲醇分別制成402.65、51.36、32.10μg/mL的混合對照品儲備液。分別量取對照品儲備液1、2、4、6、8 mL置10 mL量瓶中，用60%甲醇定容，得到系列濃度的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取“2.1”項冷浸法和熱浸法續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 浸出物特征圖譜的建立

2.2.4.1 精密度試驗 取車前草藥材（S1），按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以大車前苷色譜峰作為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD值均小于0.1%，相對峰面積RSD值均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取車前草藥材（S1），按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以大車前苷色譜峰作為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD值均小于0.5%，相對峰面積RSD值均小于2.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗 取車前草藥材（S1）6份，按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)行測定，以大車前苷色譜峰作為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD值均小于0.1%，相對峰面積RSD值均小于2.7%，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.4.4 車前草浸出物HPLC特征圖譜的建立 取車前草藥材10批，按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項制備供試品溶液，“2.2.1”項色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版），建立10批車前草浸出物的特征圖譜，經(jīng)系統(tǒng)自動匹配，生成對照圖譜。共標(biāo)定了7個共有峰，基于前期實(shí)驗室車前草的化學(xué)成分指認(rèn)[15]，確定4號峰為大車前苷，5號峰為木犀草苷，6號峰為車前草苷D。HPLC疊加色譜圖及對照圖譜R見圖1。以車前草浸出物對照圖譜R為參照，進(jìn)行整體相似度評價，結(jié)果顯示10批車前草浸出物特征圖譜相似度均大于0.99，與對照指紋圖譜具有較好的一致性，表明藥材批間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性較好。

圖1 10批車前草浸出物HPLC特征圖譜疊加圖Figue 1 HPLC characteristic spectrum overlay of 10 batches of Plantain extract

2.2.4.5 不同浸提方法的特征圖譜峰峰面積 取車前草藥材同一供試品（S4），按“2.1”、“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄不同浸提方法的特征圖譜共有峰峰面積。結(jié)果表明，以水為提取溶劑的冷浸法提取得到的供試品中，無法檢測出木犀草苷、車前草苷D和峰7。熱浸法下，車前草浸出物的特征圖譜總峰面積均高于同水平下冷浸法浸出物，浸出物的特征圖譜總峰面積順序為75%乙醇＞50%乙醇＞95%乙醇＞水。不同浸提方法的特征圖譜共有峰峰面積見表3。

表3 不同浸提方法特征圖譜共有峰峰面積Table 3 Common peak area of characteristic spectrum of Plantain extract by different extraction methods(n=3)

2.2.5 3種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.2.5.1 線性關(guān)系考察 取系列混合對照品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D的線性回歸方方程分別為Y=278 042 X-235 6、Y=398 519 X-7 948、Y=284 175 X-4 846，r2分別是0.999 9、0.999 8、0.999 7，表明大車前苷、木犀草苷、車前草苷D質(zhì)量濃度分別在40.3～322.1、5.1～41.1、3.2～25.7μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5.2 精密度試驗 取車前草藥材（S1），按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D峰面積RSD值分別為1.3%、1.5%、0.7%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取車前草藥材（S1），按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計算得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D峰面積RSD值分別為1.3%、1.0%、1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.4 重復(fù)性試驗 取車前草藥材（S1）6份，按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值分別為0.9%、0.2%、0.05%，其RSD分別為0.2%、0.2%、0.1%，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.5.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的車前草藥材粉末（S1）9份，每份1.0 g，精密稱定，按對照品加入量與所取藥材供試品中待測定成分量之比0.5∶.5∶1精密加入大車前苷、木犀草苷、車前草苷D對照品，按“2.1.2”項以75%乙醇為溶劑制備浸出物，按“2.2.3”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D的加樣回收率均值分別為96.8%、95.6%、94.0%，RSD值分別為2.1%、3.1%、1.5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.5.6 最低檢出限、最低定量限試驗 將混合對照品溶液稀釋至低濃度，以信噪比S/N≧3時確定大車前苷、木犀草苷、車前草苷D的最低檢出限（LOD）依次為23.9、19.9、25.8 ng/mL，以信噪比S/N=10時確定大車前苷、木犀草苷、車前草苷D的最低定量限（LOQ）依次為7.2、6.0、7.7 ng/mL。

2.2.5.7 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 取車前草同一供試品溶液（S4），按“2.1”、“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計算供試品中大車前苷、木犀草苷、車前草苷D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4?？梢姡煌岱椒ㄏ?，大車前苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，對總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響最大。

2.3 層次分析法結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法評價車前草浸出物提取方法

2.3.1 層次分析法對各考察指標(biāo)主觀賦權(quán) 層次分析法是一種綜合主觀判斷，使定性與定量分析有機(jī)結(jié)合，將結(jié)構(gòu)復(fù)雜、決策準(zhǔn)則多且不易量化的問題分解成一個簡單明了的多層分析結(jié)構(gòu)模型的方法[10]。本研究以浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征圖譜特征峰總峰面積和指標(biāo)成分的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)層，建立車前草浸出物提取方法判斷矩陣（見表5），權(quán)重系數(shù)采用AHP層次分析法yaahp V10軟件處理，得到各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)wj依次為0.346 9、0.454 6、0.198 5。

2.3.2 熵權(quán)TOPSIS法對各考察指標(biāo)客觀賦權(quán) 熵權(quán)TOPSIS法根據(jù)各項指標(biāo)測得值的大小來確定指標(biāo)權(quán)重，能客觀、全面反映各指標(biāo)的相對重要程度，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。以浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、3個指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征峰總峰面積原始數(shù)據(jù)為初始決策矩陣，根據(jù)公式（1）、（2）將矩陣轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣，i為樣本數(shù)（i=1，2，…，m），j為評價指標(biāo)（j=1，2，…，n）；根據(jù)公式（3）計算不同浸提方法對各評價指標(biāo)的熵值Ej依次為0.785 6、0.862 3、0.833 6；再根據(jù)公式（4）對熵值進(jìn)行處理，得到各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)vj依次為0.413 6、0.265 5、0.320 9。

表4 不同浸提方法下指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果Table 4 The index component content of Plantain extract by different extraction methods(n=3 w/%

表5 車前草浸出物提取方法判斷矩陣表Table 5 Judgment matrix of extraction method of plantain extract

2.3.3 組合賦權(quán) 在浸提方案優(yōu)選上，層次分析法受主觀因素的干擾，無法很好地客觀反映事實(shí)；熵權(quán)法雖能客觀反映事實(shí)，但要求樣本數(shù)量盡可能多。將層次分析法與熵權(quán)法結(jié)合求組合權(quán)重，在一定程度上減少了主觀因素對方法決策的影響，也擴(kuò)大了熵權(quán)法的利用范圍[11,13?14]。根據(jù)公式（5），計算得到浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、3個指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征峰總峰面積的權(quán)重系數(shù)Wj分別為0.387 1、0.355 0、0.257 9。其中，α取0.5。

2.3.4 車前草浸出物提取方法綜合評價 以浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征圖譜特征峰總峰面積及3個指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價指標(biāo)，結(jié)合組合權(quán)重系數(shù)Wi對提取工藝進(jìn)行綜合評價。綜合評分值=浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)/浸出物最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100×W1+3種指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)/3種指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最大值×100×W2+特征峰總峰面積/特征峰總峰面積最大值×100×W3。車前草浸出物綜合評價結(jié)果見表6。結(jié)果表明，以熱浸法、75%乙醇為溶媒的綜合評分最高，排名第一。故優(yōu)選車前草浸出物測定方法為：以75%乙醇為溶媒，按醇溶性浸出物測定法（2020年版《中國藥典》通則2201）項下的熱浸法測定。

2.4 熵權(quán)TOPSIS法分析不同產(chǎn)地車前草藥材質(zhì)量

取不同產(chǎn)地的10批車前草藥材，以熱浸法、75%乙醇為溶劑制備浸出物，計算車前草浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、3個指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及特征圖譜各共有峰峰峰面積，結(jié)果見表7、8。熵權(quán)TOPSIS法通過計算各指標(biāo)對最優(yōu)方案的貼近度，實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)決策分析，貼近度越大，越貼近理想值，被評價事物越優(yōu)[11]。以不同產(chǎn)地車前草浸出物為原始數(shù)據(jù)，建立初始決策矩陣，根據(jù)計算公式（1）～（4）計算得到每個指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)；根據(jù)公式（6）確定加權(quán)決策矩陣Z；根據(jù)公式（7）、（8）計算得出最優(yōu)方案Z+與最劣方案Z-，再根據(jù)公式（9）計算每個樣品與最優(yōu)最劣方案的距離D，得到最優(yōu)解的歐氏貼近度Ci，并進(jìn)行排序，結(jié)果見表9。

表6 車前草浸出物提取方法綜合評價結(jié)果Table 6 Comprehensive evaluation results of extraction method of Plantain extract

表7 10批車前草浸出物及3個指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 7 Determination of 10 batches of Plantain extract and 3 index components（n=2） w/%

表8 10批車前草浸出物特征圖譜共有峰峰面積Table 8 Common peak area of 10 batches of Plantain extract（mAu，n=2）

可見，江蘇、江西、四川、安徽4省車前草浸出物的平均Ci值分別為0.604 1、0.650 6、0.258 8、0.477 6，表明江蘇、江西兩省所產(chǎn)車前草藥材浸出物接近，質(zhì)量優(yōu)于四川、安徽兩省的車前草。

3 討論

車前草是臨床上常用的一味傳統(tǒng)中藥，其藥用歷史悠久，藥源豐富。2020年版《中國藥典》僅規(guī)定車前草熱浸法下的水溶性浸出物含量，對車前草醇溶性浸出物含量未進(jìn)行規(guī)定。本研究以水和不同比例的乙醇為溶劑，采用冷浸、熱浸2種方式進(jìn)行提取，結(jié)果顯示浸出物各指標(biāo)結(jié)果在不同提取條件下均存在明顯差異。以水為溶媒提取的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖高，但指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和特征圖譜共有峰總面積最低，且實(shí)驗過程中過濾速度較慢，不利于操作；以95%乙醇為溶媒提取的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，有效成分提取不完全；50%乙醇和75%乙醇提取出的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征圖譜共有峰總峰面積差異不明顯。

編號S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10產(chǎn)地江蘇省江蘇省江蘇省江西省江西省四川省四川省四川省安徽省安徽省Di+0.162 8 0.132 4 0.118 5 0.153 9 0.077 7 0.232 0 0.209 0 0.314 0 0.158 2 0.194 6 Di?0.194 6 0.221 2 0.212 6 0.169 3 0.271 2 0.125 4 0.154 8 0.000 0 0.170 3 0.150 9 Ci 0.544 5 0.625 6 0.642 1 0.523 9 0.777 2 0.350 9 0.425 5 0.000 0 0.518 5 0.436 7排名43251981 067

本研究考慮到中藥有效成分的現(xiàn)代藥理學(xué)作用，認(rèn)為指標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、特征圖譜共有峰總面積較為重要，人為因素影響較大，所得權(quán)重系數(shù)具有一定主觀性。熵權(quán)TOPSIS法的權(quán)重系數(shù)完全依據(jù)客觀的實(shí)驗數(shù)據(jù)，能真實(shí)反映提取制備過程中各指標(biāo)變化規(guī)律，但所需樣本數(shù)量大，忽略了中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性。本研究運(yùn)用層次分析法和熵權(quán)TOPSIS法對多項指標(biāo)進(jìn)行組合賦權(quán)，既綜合了車前草中有效成分的藥理作用，又能體現(xiàn)中藥化學(xué)成分復(fù)雜性的特點(diǎn)，主觀賦權(quán)與客觀賦權(quán)結(jié)合，所得工藝更科學(xué)、合理。

在此基礎(chǔ)上，根據(jù)優(yōu)選的浸出物測定方法，對不同產(chǎn)地的10批車前草藥材浸出物進(jìn)行測定，運(yùn)用熵權(quán)TOPSIS法對各指標(biāo)進(jìn)行客觀評價，結(jié)果顯示產(chǎn)自江蘇、江西兩省的車前草浸出物質(zhì)量接近，優(yōu)于安徽、四川兩省的車前草，為優(yōu)選車前草產(chǎn)地提供了實(shí)驗依據(jù)。

本研究建立的車前草藥材浸出物及特征圖譜測定方法，全面反映了車前草提取程度、量和質(zhì)的整體信息，為進(jìn)一步完善車前草藥材的質(zhì)量評價提供了理論依據(jù)。