唐超 蔡琳 張藝文 汪漢

(西南交通大學附屬醫(yī)院 成都市第三人民醫(yī)院心內科 成都市心血管病研究所，四川 成都 610031)

2019年底開始，新型冠狀病毒肺炎從湖北武漢迅速傳播到中國各省及全球，嚴重危害到了人類健康。本次由2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)引發(fā)的疾病被世界衛(wèi)生組織命名為2019冠狀病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。2019-nCoV與引起嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)和中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)的冠狀病毒關系密切，同為β屬冠狀病毒，并且具有相同的血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體[1]。COVID-19在流行病學上表現(xiàn)為潛伏期長、傳染性強和人群普遍易感的特點，從中醫(yī)觀點看，歸于“疫病”范疇?；颊吒腥?019-nCoV后不僅有發(fā)熱、乏力和干咳等典型的臨床表現(xiàn)，還有與病毒感染相關的心臟受損的癥狀，其中，心肌炎是COVID-19患者心臟受損的重要表現(xiàn)之一[2]，其可能的發(fā)病機制為全身炎癥反應。而血必清注射液具有補脾益氣和清熱解毒的功效，臨床上用于治療因呼吸系統(tǒng)疾病和泌尿系統(tǒng)疾病等感染引起的全身炎性反應綜合征，對因感染、創(chuàng)傷和燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征(瘀毒互結和熱毒內陷證)患者的器官功能受損期和衰竭早期也有一定作用，推測血必清注射液可能是2019-nCoV感染合并心肌炎的一種潛在治療藥物[3]。

血必清注射液是紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸等中藥材提取物，主要成分為紅花黃色素A等，用于溫熱類疾病，癥見發(fā)熱、喘促、心悸和煩躁等瘀毒互結證，適用于因感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征，也可配合治療多器官功能失常綜合征的臟器功能受損，但其作用機制尚不明確[4]。在治療2019-nCoV感染的處方中，血必清注射液是新冠2號和新冠3號的推薦中成藥[5]。因中藥所含有效成分復雜，僅通過實驗對其作用機制進行全面研究較為困難，而網(wǎng)絡藥理學則融合了藥理學、系統(tǒng)生物學、計算機生物學及網(wǎng)絡分析等多學科的技術和內容，通過構建“藥物-活性成分-靶標-疾病”多層網(wǎng)絡來分析藥物作用于疾病的機制。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，對血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的作用機制進行系統(tǒng)分析，為血必清注射液的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，UniProt數(shù)據(jù)庫(UniProt，https：//www.uniprot.org/),GeneCards數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https：//www.genecards.org),OMIM數(shù)據(jù)庫(OMIM，https：//www.omim.org),Cytoscape 3.6.1軟件(Cytoscape，https：//cytoscape.org),STRING數(shù)據(jù)庫(String，https：//string-db.org/)和R 3.6.2軟件(R，https：//www.r-project.org)。

1.2 藥物活性成分及靶點

TCMSP可提供中藥主要成分、靶點和疾病的信息，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug likeness，DL)是篩選藥物主要成分常用的參數(shù)。借助TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索血必清注射液的主要組成成分：紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸，篩選出OB≥30%和DL≥0.18的化合物作為血必清注射液的主要成分，并根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“related targets”功能，篩選出與其化合物相對應的靶點。此外，利用UniProt數(shù)據(jù)庫把靶點蛋白名稱統(tǒng)一轉化為基因名稱，刪除部分不規(guī)范的靶點。

1.3 疾病靶點的預測

GeneCards數(shù)據(jù)庫收錄了較全面的人類基因信息，包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和遺傳學等。OMIM數(shù)據(jù)庫主要對人類基因和表型及其之間的關系進行了全面描述。在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別檢索2019-nCoV和心肌炎，然后把兩個數(shù)據(jù)庫的檢索內容合并取交集，交集所得結果即2019-nCoV感染合并心肌炎的相關靶點。

1.4 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點預測

藥物和疾病的共同靶點即藥物作用于疾病的潛在靶點。通過使用R軟件中的“VennDiagram”安裝包對血必清注射液和2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點取交集，兩者的共同靶點即血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相關靶點。

1.5 可視化網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

蛋白互作網(wǎng)絡和“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡能更明確地顯示藥物和疾病之間復雜的相互關系。藥物的活性成分可直接或間接作用于疾病靶點從而發(fā)揮治療作用，而疾病的形成和治療與其靶點也有著直接或間接的關系。血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相關靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫來構建蛋白互作網(wǎng)絡，物種設置為“人”(“Homo sapiens”)。根據(jù)靶點蛋白相互作用連線數(shù)目進行排序，連線數(shù)目越大表示該靶點蛋白在藥物治療疾病過程中所起作用越大，選用蛋白互作網(wǎng)絡中連線數(shù)目最多的30個靶點蛋白作為關鍵靶點。利用Cytoscape軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。網(wǎng)絡主要包括藥物、藥物活性成分、疾病及其靶點四類節(jié)點，兩節(jié)點之間均以邊相連。

1.6 基因本體及通路富集分析

基因本體(gene ontology，GO)富集分析常用于注釋基因及其基因產(chǎn)物的功能，包括分子功能、生物過程和細胞組分三個生物學范疇。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)可對靶點進行通路富集分析，有利于探索藥物治療疾病的作用機制。利用R軟件的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”安裝包對血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的靶基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并以P<0.05作為篩選條件，將前20條富集顯著的結果進行圖表可視化。

2 結果

2.1 血必清注射液的活性成分及靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索血必清注射液的主要組成成分：紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，刪除無相對應靶點的化合物、重復或無相對應基因名稱的靶點蛋白，最終獲得125個符合條件的有效成分(紅花22個，赤芍29個，川芎7個，丹參65個，當歸2個)，其對應6 933個相關靶點(紅花1 466個，赤芍681個，川芎1 356個，丹參2 566個，當歸864個)，共215個靶基因。

2.2 2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫分別檢索COVID-19和心肌炎，并把兩個數(shù)據(jù)庫的檢索結果合并，獲得COVID-19相關基因359個，心肌炎相關基因1 062個，然后把以上兩種疾病的相關基因取交集，最終獲得2019-nCoV感染合并心肌炎的靶基因177個。

2.3 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相關靶點及“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

對215個血必清注射液的靶基因和177個2019-nCoV感染合并心肌炎的相關基因進行Venn分析，獲得41個疾病和藥物的共同基因，即為血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的潛在靶點，其對應血必清注射液化合物71個。將疾病、藥物以及篩選得到的藥物活性成分、疾病和藥物的共同靶點導入Cytoscape軟件進行“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建，見圖1。網(wǎng)絡中共有78個節(jié)點(35個化合物、41個靶點、1個疾病和1個藥物)，235條邊，不同形狀(或不同顏色)的節(jié)點分別代表藥物、藥物活性成分、靶點和疾病。

注：長方形節(jié)點：血必清注射液活性成分；圓形節(jié)點：疾病-藥物的共同靶點。圖1 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡的構建及關鍵靶點篩選

通過將疾病和藥物的共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，設定物種為人，并隱藏蛋白互作得分<0.4的邊，構建蛋白互作網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡中有41個相互作用節(jié)點，496個邊，結果見圖2。網(wǎng)絡中各節(jié)點代表不同的靶點蛋白，不同顏色的邊代表不同的相互作用類型，靶點蛋白間相互作用連線的數(shù)目與該靶點在藥物治療疾病過程中所起作用相關。按照相互作用連線的數(shù)目大小進行排序，選用連線數(shù)目最多的30個靶點蛋白作為關鍵靶點，包括白介素(IL)-6、IL-10、白蛋白(ALB)、C-X-C基序趨化因子8(CXCL8)、IL-1β、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、胱天蛋白酶3(CASP3)、趨化因子2(CCL2)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-4、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、胱天蛋白酶8(CASP8)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、轉錄因子(RELA)、原癌基因(FOS)、IL-2、過氧化氫酶(CAT)、表皮生長因子受體(EGFR)、信號轉導與轉錄因子1-α/β(STAT1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、C-X-C基序趨化因子10(CXCL10)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、纖溶酶原激活物抑制物1(SERPINE1)、內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、C反應蛋白(CRP)、雌激素受體1(ESR1)、CD40配體(CD40LG)和干擾素調節(jié)因子1(IRF1)，并將上述靶點蛋白做出柱狀圖，見圖3。

注：節(jié)點：靶點蛋白；不同顏色的邊：不同的相互作用類型。圖2 血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的蛋白互作網(wǎng)絡圖

注：橫坐標：相互作用連線的數(shù)目；縱坐標：靶點蛋白。圖3 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的關鍵靶點

2.5 GO及KEGG富集分析

利用R軟件對血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的相關基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，兩者均以P<0.05作為篩選條件，P值越小富集越顯著，在其功能或通路上的基因越多。在GO富集分析中含有71個生物學過程，根據(jù)P值大小進行排序，選取富集前20位的生物學過程，見表1。表1顯示，血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎，主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結合和趨化因子受體結合等多種生物學過程。KEGG富集通路發(fā)現(xiàn)，41個疾病-藥物共同靶點顯著富集在135條通路上，其中前20條富集顯著通路的具體信息見圖4?？v軸為通路名稱，橫軸為基因比值。基因比值的大小表示富集程度的高低，點的大小表示富集的靶點基因數(shù)量，點的顏色從紅色到藍色表示P值從小到大。血必清注射液在治療2019-nCoV感染合并心肌炎中主要通過糖尿病并發(fā)癥相關的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、Chagas病和甲型流感等疾病相關通路發(fā)揮作用。

3 討論

隨著計算機信息學的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡藥理學為研究中藥的多成分及復雜的作用機制提供了新的研究方法。網(wǎng)絡藥理學從整體考慮藥物與疾病的相關性，強調藥物、靶點與疾病間相互作用的系統(tǒng)性，反映中成藥的多成分、多靶點和多通路的作用特點[6]。因此，本研究首先使用TCMSP數(shù)據(jù)庫對血必清注射液的中藥活性成分進行篩選；運用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫對疾病靶點進行預測篩選，構建活性成分靶點網(wǎng)絡圖。將得到的靶點利用STRING進行蛋白互作網(wǎng)絡構建，并進行GO和KEGG富集分析，構建靶點信號通路網(wǎng)絡圖，從而發(fā)現(xiàn)血必清注射液主要的活性成分、主要作用的靶點和調節(jié)的通路。具體發(fā)現(xiàn)有：血必清注射液5個最主要的中藥活性成分為：紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸。研究結果顯示血必清注射液與2019-nCoV感染合并心肌炎的交集靶點共有41個，其對應血必清注射液的活性成分主要包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚和黃芩素等。研究表明血必清注射液可通過調節(jié)免疫功能發(fā)揮抗病毒作用，且有明確的抗炎機制，可能作為COVID-19的潛在抑制劑[7]。槲皮素具有抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫和保護心肌缺血再灌注損傷等作用。槲皮素可通過抑制核因子κB信號通路減少核因子κB的產(chǎn)生，從而達到抗炎的作用[8]。木犀草素能抑制流感病毒的增殖和炎性細胞因子的表達，影響Toll樣受體通路和凋亡相關因子的表達，減輕病毒對宿主細胞的免疫損傷，發(fā)揮抗病毒作用[9]。β-谷甾醇對脂多糖致急性肺損傷有一定的保護作用，亦可改善非酒精性脂肪肝患者肝細胞脂肪變性程度，減輕氧化應激反應，從而對肝臟起到保護作用[10]。研究表明，山奈酚具有良好的抗菌活性，對耐甲氧青霉素的金黃色葡萄球菌也有作用，在抗病毒方面，山奈酚在非細胞毒性濃度呈濃度依懶性抑制。黃芩素可減弱炎癥反應、氧化應激及肺組織細胞凋亡，可能通過抑制p38 MAPK通路發(fā)揮對肺組織的保護作用[11]；同時可抑制新生血管形成，通過降低血壓和擴張血管等方式發(fā)揮保護心腦血管的作用；亦可直接清除活性氧，減輕缺血再灌注心肌細胞氧化應激反應，提高心肌細胞的生物功能和存活率[12]。

表1 血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的主要生物學過程(前20個)

通過蛋白互作網(wǎng)絡分析篩選出血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的關鍵靶點，包括IL-6、IL-10、ALB、CXCL8和IL-1β等，分析發(fā)現(xiàn)這些靶點主要與炎癥反應、免疫調控以及細胞的增殖、分化和凋亡等密切相關。IL-6和IL-10在炎癥反應中起重要作用，能參與免疫反應的細胞增殖和分化[13]。研究表明宿主細胞可通過蛋白的泛素化修飾抑制MAPK/ERK通路，從而抑制病毒感染[14]。

GO和KEGG富集結果表明血必清注射液通過多種生物學過程和多條信號通路參與2019-nCoV感染合并心肌炎的治療過程。從GO富集分析結果可得知，共同靶點主要涉及生物學過程有細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結合和趨化因子受體結合等。KEGG通路富集分析結果顯示，血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點主要涉及糖尿病并發(fā)癥相關的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、Toll樣受體信號通路及多種疾病等多條通路。其中，糖尿病并發(fā)癥相關的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路和TNF信號通路已被證實與2019-nCoV感染相關[15]。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路與血管損傷、炎癥反應和動脈粥樣硬化密切相關，通路激活可導致活性氧過量產(chǎn)生，核因子κB活化，黏附因子和細胞因子表達增加[16]。TNF信號通路和IL-17信號通路均能調控細胞凋亡，是炎癥反應過程中重要的通路。Toll樣受體信號通路是免疫反應過程中的重要通路，三萜類化合物可通過Toll樣受體信號通路減輕脂多糖引起的心肌功能障礙[17]。由此推測，血必清注射液是通過抑制炎癥反應，調節(jié)免疫功能和調控細胞凋亡來治療2019-nCoV感染合并心肌炎。

圖4 血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的主要通路(前20條)

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法探討了血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的活性成分及可能的作用機制，結果顯示血必清注射液的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚和黃芩素，其主要通過調節(jié)IL-6、IL-10、ALB、CXCL8、IL-1β、MAPK8和CASP3等靶點，調控AGE-RAGE、IL-17和TNF等信號通路來抑制炎癥反應，調節(jié)免疫功能和調控細胞凋亡，從而達到治療2019-nCoV感染合并心肌炎的目的。本研究仍存在一定的局限性，如網(wǎng)絡藥理學基于數(shù)據(jù)進行的研究，有關疾病和藥物的資料收集的結果可能不全面，以及通過數(shù)據(jù)庫篩選出的中藥活性成分可能與實際吸收進入人體循環(huán)的藥物成分有差異。因此仍需進一步的實驗來驗證本研究結果。