曹楨，陳善敏，黃小雨，蔣和體

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400700)

甘薯營養(yǎng)成分豐富,紫薯不同于傳統(tǒng)的甘薯品種，還擁有含特殊保健功能的花青素、硒元素、花色苷等，因而具有抗氧化、緩解高血壓和增強(qiáng)記憶力等多種功能。TANG等[1]對3種薯色紫薯進(jìn)行成分測定分析，發(fā)現(xiàn)紫心紫薯由于富含花青素，其抗氧化能力遠(yuǎn)高于橘心和白心紫薯。

紫薯在傳統(tǒng)加工領(lǐng)域如鮮食、飼料、方便小食品等方面應(yīng)用廣泛，但加工方法單一，附加值低。紫薯中活性成分豐富，將其釀醋，能最大限度增加經(jīng)濟(jì)效益。食醋的風(fēng)味和營養(yǎng)價值是評價食醋品質(zhì)是否優(yōu)良的重要指標(biāo)[2]，而紫薯醋中的各種活性成分含量決定了紫薯醋的營養(yǎng)價值。目前對這些活性成分的研究主要集中在含量動態(tài)變化、品種差異、活性成分的提取、分離純化、抗氧化作用等方面[3-4]。

紫薯花色苷是紫薯中最主要的活性成分，許多研究表明，其與體外抗氧化能力密切相關(guān)，且在一定濃度范圍內(nèi)，花色苷濃度與體外抗氧化能力成正相關(guān)，而紫薯花青素在復(fù)雜的發(fā)酵過程中，因發(fā)酵時間過長、溫度較高等因素而損失[5-6]。本研究探究了在發(fā)酵紫薯醋的工藝流程中保存紫薯中活性物質(zhì)的一種方法，提高了紫薯醋的營養(yǎng)價值，提升了紫薯的附加價值，對紫薯深加工產(chǎn)品具有一定理論指導(dǎo)意義。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑

渝紫7號，重慶市石柱縣；紫薯酒，實驗室自制；釀酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌巴氏亞種1.41，中國微生物菌種保藏管理中心。

3，5-二硝基水楊酸、石油醚、丙酮、碳酸鈣、硫酸鎂(分析純)，重慶川東化工有限公司；磷酸二氫鉀(分析純),成都市科龍化工試劑廠;DPPH(95%)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪) 二鹽酸鹽[2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH]、熒光素鈉(分析純),阿拉丁試劑有限公司;抗壞血酸、β-胡蘿卜素、沒食子酸、蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品)、福林酚試劑(分析純)，SOLARBIO生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-26 電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HDL-4 離心機(jī)，金壇市鴻科儀器廠；(T)YAIBO 15/8 高壓滅菌鍋，上海宜川上嶺儀表有限公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；UNICO 7200 分光光度計，上海巴玖實業(yè)有限公司；R502B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，西安太康生物科技有限公司；UltraScan PRO 全自動色差儀，美國Hunter Lab公司；SYHERGY H1 多功能酶標(biāo)儀，5BioTek有限公司；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫薯醋釀造工藝流程

1.3.1.1 紫薯醋釀造工藝流程

紫薯醋釀造工藝流程如下：

1.3.1.2 紫薯色素回添醋釀造工藝流程

紫薯色素回添醋釀造工藝流程如下

1.3.1.3 操作要點

(1)紫薯粉：鮮紫薯洗凈，切成3 mm薄片，真空冷凍干燥24 h，粉碎后過80目篩得紫薯粉，裝袋放于干燥器避光保存。

(2)微波輔助提取紫薯色素[7-8]：以10 g/L的檸檬酸溶液為提取劑，紫薯粉做原料，在微波功率為560 W，液料比為22.8 mL/g時作用4.6 min，反復(fù)3次，離心(3 500 r/min,10 min)后保留上清液。

(3)糖化液化：紫薯渣為原料，按0.5 mg/kg添加α-淀粉酶，45 ℃作用4 h。

(4)酒精發(fā)酵：酶解后的原料接種活化后的酵母菌，25 ℃下發(fā)酵。

(5)醋酸發(fā)酵：調(diào)整酒精發(fā)酵液的初始酒度為7.35%vol、裝液量為28%、溫度為30 ℃、發(fā)酵時間11 d。

1.3.2 基礎(chǔ)指標(biāo)測定

總糖采用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)比色法；總酸采用GB/T 12456—2008中pH電位法；β-胡蘿卜素采用比色法[9]；VC采用GB 5009.86—2016 2,6-二氯靛酚滴定法；總酯采用GB/T 19777—2013地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋中的連續(xù)電位滴定法；總酚測定采用Folin-Ciocalteu比色法[10]；總黃酮采用SN/T 4592—2016 出口食品中總黃酮的測定。

1.3.3 色澤的測定

色差計法[11-12]。根據(jù)CIELAB色彩空間，測定紫薯醋的亮度值L*、紅綠值a*和黃藍(lán)值b*，同一樣品取6個不同位置測定，取平均值，并按照公式(1)、公式(2)計算其彩度C*和色調(diào)角H0。

(1)

(2)

1.3.4 花青素的測定

采用pH示差法[13]?？偦ㄇ嗨睾堪垂?3)和公式(4)計算。

(3)

A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5

(4)

式(3)中：A為公式(4)計算所得；Mw為分子質(zhì)量(449.2 g/mol)，DF為稀釋倍數(shù)，ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)[26 900 L/(mol·cm)]，l為光程(1.0 cm)。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 氧化自由基吸收能力

參照TEOW[14]的方法。AUC(area under curve)值和氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)值按公式(5)、公式(6)計算，結(jié)果以μmol/mL表示。

AUC=4×f0+f1+...fn-1+fn-f0-fn

(5)

(6)

式(5)中:AUC，熒光衰退面積；fn，第n個測定點的相對熒光強(qiáng)度。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率

參照RUMBAOA[15]的方法。結(jié)果按公式(7)進(jìn)行計算，以 μg/mL表示。

DPPH/(μg·mL-1)=x×DF

(7)

式(7)中：x，吸光度對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.6 香氣成分萃取與分析

1.3.6.1 同時蒸餾萃取法萃取紫薯醋揮發(fā)性成分

分別量取50 mL紫薯醋和50 mL二氯甲烷于2個500 mL圓底燒瓶，紫薯醋放置于樣品端，油浴加熱并保持溶液微沸。溶劑端于50 ℃水浴中回流2 h?；亓鹘Y(jié)束后，加入3～5 g無水Na2SO4并放于-20 ℃冰箱過夜除水，取出快速過濾，然后旋蒸濃縮至5～6 mL，再氮吹至1 mL，置于-20 ℃條件下，以待GC-MS聯(lián)機(jī)分析[16]。

1.3.6.2 氣相色譜條件

色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：45 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至80 ℃，以7 ℃/min升至150 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，以1 ℃/min升至210 ℃，以7 ℃/min升至230 ℃；載氣流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣[17-18]。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電子電離EI源；電子能源70 eV；燈絲發(fā)熱電流0.25 mA；電子倍增器1 000 V；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z)40～450[17]。

1.3.6.4 揮發(fā)性成分的定性與定量分析

GC-MS檢測所得化合物質(zhì)譜圖經(jīng)質(zhì)譜庫(NIST05.LIB/NIST05 s.LIB)檢索，結(jié)合檢索結(jié)果相似性高低及保留指數(shù)法進(jìn)行定性，采用2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，按照面積歸一化法確定各香氣組分的相對含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對醋酸發(fā)酵的影響

由圖1可知，在0～11 d的發(fā)酵期內(nèi)，前7 d紫薯醋的總酸含量增加量較緩慢，7 d后增速顯著加快，在第11天總酸含量達(dá)到5.68 g/100 mL，11 d后，總酸含量變化幅度小，考慮到時間成本，選取發(fā)酵時間為11 d。

圖1 發(fā)酵時間對紫薯醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid of sweet potato vinegar

2.2 初始酒度對醋酸發(fā)酵的影響

由圖2可知，可以觀察到酒精度為7%vol時的初產(chǎn)酸量要顯著高于9%vol和11%vol的初始產(chǎn)酸量，但4 d以后該趨勢消失，但整體趨勢都是隨著發(fā)酵時間的延長，醋酸含量也緩慢增加。這可能是酒精度9%vol和11%vol，會對醋酸菌的生長有一定抑制作用，但同時醋酸菌也能利用一部分底物進(jìn)行產(chǎn)酸，但產(chǎn)酸量低于酒精度7%vol。4 d以后，底物對醋酸菌的抑制作用減弱，酒精度為9%vol中的醋酸菌開始大量繁殖產(chǎn)酸，而11%vol組仍對醋酸菌有抑制作用。從總酸含量來看，初始酒度為9%vol的發(fā)酵效果較好，但考慮到發(fā)酵底物的節(jié)約，選擇7%vol為最佳初始酒度。

圖2 酒精度對紫薯醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid of sweet potato vinegar

2.3 裝液量對醋酸發(fā)酵的影響

裝液量對紫薯醋總酸含量影響如圖3所示。除了裝液量20%外，其他組在0～6 d，產(chǎn)酸量差別不大，6 d之后，裝液量越少，產(chǎn)酸量增加比例越大，產(chǎn)酸越多，其中裝液量為25%時，總酸含量最大可達(dá)6.48 g/100mL。而裝液量過低(20%)，雖然前期產(chǎn)酸量快，但發(fā)酵中期后，隨著溶氧度以及發(fā)酵底物的損失，生成的醋酸進(jìn)一步氧化為二氧化碳和水，造成醋酸含量最低。綜合考慮，選取25%作為最佳裝液量。

圖3 裝液量對紫薯醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of the liquid volume on total acid of sweet potato vinegar

2.4 響應(yīng)面設(shè)計

基于單因素試驗，采用Box-Benhnken 試驗原理，將總酸度作為響應(yīng)值，設(shè)計發(fā)酵時間(A)、初始酒度(B)、裝液量(C)3因素3水平的中心組合試驗，并通過試驗得到響應(yīng)面結(jié)果，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface design

2.4.1 回歸模型的建立及顯著性分析

總酸是醋品品質(zhì)評價的重要指標(biāo)，因此，本試驗將總酸含量作為響應(yīng)值，對發(fā)酵時間(A)、初始酒度(B)與裝液量(C)3個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化紫薯醋酸發(fā)酵工藝。按表2進(jìn)行回歸分析，總酸含量(R)的回歸方程如下：

R=-9.748 52+2.598 92A-18.025 30B+5.286 13C-0.108 50AB-0.023 650AC-0.107 50BC-0.032 525A2+1.246 23B2-0.066 861C2。

根據(jù)方差分析結(jié)果(表3)，模型P值為0.019 0，表明模型項顯著；失擬項P值0.783 1不顯著，表明在試驗參數(shù)范圍內(nèi)，模型合理，可用來推測與分析紫薯醋酸發(fā)酵試驗結(jié)果。方程決定系數(shù)R2(Adj)=0.872 9，變異系數(shù)<15%，表明響應(yīng)值總酸含量的實際值與預(yù)測值之間具有良好一致性，模型可靠。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

前文分析過，F(xiàn)值的因素其對響應(yīng)值影響越顯著。因此，3個因素對總酸含量的影響順序為B(初始酒度)>C(裝液量)>A(發(fā)酵時間)，其中一次項B、平方項B2、C2對響應(yīng)值影響極顯著(P<0.01)，其他因素組合對總酸含量無顯著影響(P>0.05)。

2.4.2 驗證試驗

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，得紫薯醋酸發(fā)酵最優(yōu)條件為發(fā)酵時間11.23 d，初始酒度7.35%vol，裝液量27.66%vol，總酸含量7.064 g/100g。為更好操作，調(diào)整工藝條件為發(fā)酵時間11 d，初始酒度7.35%，裝液量28%。經(jīng)過3次重復(fù)性試驗，總酸含量為6.92 g/100mL，與模型預(yù)測值相差較小，誤差為±0.43%。該模型能夠較好預(yù)測醋酸發(fā)酵條件與總酸含量的關(guān)系，模型可用。

2.5 指標(biāo)測定結(jié)果分析

2.5.1 指標(biāo)測定結(jié)果

指標(biāo)測定結(jié)果見表4，除了總糖含量無顯著差異外，2種紫薯醋的其他指標(biāo)均差異顯著(P<0.05)。紫薯色素回添醋的總酸、總酯、總多酚、總黃酮、花青素含量和抗氧化能力均強(qiáng)于紫薯醋。同時，提取色素后損失較多的營養(yǎng)成分為維生素。此外，紫薯醋的亮度值L*、紅綠值a*和黃藍(lán)值b*均大于紫薯色素回添醋且存在顯著性差異(P<0.05)，亮度值越大，醋品的顏色反而越淺，紫薯色素回添醋的顏色要深于紫薯醋。這是因為提取后的紫薯花青素回添到紫薯醋中后，其在酸性條件下穩(wěn)定且呈深紫色[19]。

表4 兩種紫薯醋品質(zhì)指標(biāo)Table 4 Quality indicators of different purple sweet potato vinegar

2.5.2 活性成分損失對比

紫薯原料和2種紫薯醋中發(fā)酵前后活性成分含量及損失率見表5。由表5可知，未經(jīng)發(fā)酵的紫薯原料中活性成分含量最高，其總多酚、總黃酮和花青素含量分別為2 303.06、281.74和346.22 mg/L，紫薯色素回添醋次之，紫薯醋最低且三者間具有顯著性差異(P<0.05)。發(fā)酵使紫薯原料中的活性成分損失較大，對于直接發(fā)酵的紫薯醋來說，總多酚、總黃酮、花青素含量較原料分別損失75.59%、63.63%和72.75%，均超過50%，而采用先發(fā)酵再回添的發(fā)酵方式制得的紫薯色素回添醋較紫薯醋的總多酚、總黃酮、花青素?fù)p失率分別降低10.34%、15.61%和42.93%，其中，該發(fā)酵方式對花青素的保存尤其顯著，這說明提取色素后再回添的方式有利于紫薯中活性成分的保存。

表5 紫薯原料與2種紫薯醋活性成分損失對比Table 5 Active ingredient loss comparison of purple sweet potato and two kind of its vinegar

2.6 香氣成分分析

采用GC-MS技術(shù)對2種紫薯醋濃縮物進(jìn)行測定和分析，峰表對照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和解析，結(jié)合文獻(xiàn)，分別鑒定出各濃縮液的揮發(fā)性香氣成分及香氣描述，2種紫薯醋共鑒定出114種揮發(fā)性香氣成分，包含酸類18種，酯類37種，醇類18種，酚類3種，醛酮類17種，烷烴類14種，其他物質(zhì)7種。但2種紫薯醋所鑒定出的揮發(fā)性香氣成分的種類和含量具有較大差異，見圖4。2種紫薯醋所鑒定出的相同組分一共有41種，包含有8種酸類，12種酯類，6種醇類和醛酮類，7種烷烴類，其他化合物2種。此外，紫薯醋和紫薯色素回添醋中分別鑒定出76種和82種揮發(fā)性香氣成分，雖然2種紫薯醋鑒定出的化合物數(shù)量相差較小，但化合物種類有較大差異，紫薯醋中醛酮類和酚類物質(zhì)較多，而紫薯色素回添醋中含有較多醇類和烷烴類物質(zhì)。研究表明，紫薯醋中所含的主要香氣成分有乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯甲醛、大馬士酮等[17, 20]。

a-物質(zhì)數(shù)量；b-相對含量圖4 兩種紫薯醋萃取得到的物質(zhì)數(shù)量和相對含量Fig.4 The number and relative content of components extracted by two purple sweet potato vinegar

酸類物質(zhì)大多由酯類降解生成，其中本文中含量較高的乙酸是醋酸發(fā)酵的結(jié)果，而2種紫薯醋中共有的酸類物質(zhì)均有刺激性味道。但由于酸類物質(zhì)香氣閾值較高[21]，因此不是主要的風(fēng)味物質(zhì)，而主要起調(diào)節(jié)作用。

許多酯類呈現(xiàn)鮮明的果香、花香，其產(chǎn)生途徑包括酵母的酶促反應(yīng)和有機(jī)酸與醇的酯化反應(yīng)[22]。醋酸發(fā)酵原料紫薯酒中乙醇含量較高，同時在酵母菌、醋酸菌以及其他微生物的作用下，生成更多酸類、醇類物質(zhì)，而這2種物質(zhì)在發(fā)酵和陳釀期間發(fā)生酯化反應(yīng)從而生成酯類物質(zhì)，在2種紫薯醋中，分別有24種和28種酯類，其中共有的乙酯類化合物有8種，它們可能是乙醇與紫薯酒在發(fā)酵過程中生成的酸類物質(zhì)反應(yīng)的結(jié)果。

多數(shù)醇類具有花草香或者果香，本次2種紫薯醋檢測出的主體醇類物質(zhì)有苯乙醇(22.47%和13.53%)、正癸醇(1.7%和10.30%)、1-十一醇(0%和1.46%)。苯乙醇呈現(xiàn)愉快的玫瑰香，正癸醇具有甜花香，1-十一醇具有檸檬香氣[23]。雖然醇類物質(zhì)的風(fēng)味閾值一般較高，但在賦予醋品醇香以及脂肪酸酯化方面可以起到積極作用[24]。但由于萃取方法為同時蒸餾萃取法，因?qū)悠愤M(jìn)行加熱處理，大分子化合物可經(jīng)Stretcher降解繼續(xù)生成較小分子量的醛，進(jìn)而還原為醇[25]。本次研究中所檢測出的苯乙醇，很大可能就是經(jīng)過該途徑生成。

至于物質(zhì)數(shù)量相對較少的烷烴類和其他類，兩者相對含量僅占化合物總量的3.27%和12.01%，其中烷烴類對醋品風(fēng)味基本沒有貢獻(xiàn)。此外，紫薯醋中還特有3種酚類物質(zhì)，分別為愈創(chuàng)木酚(0.37%)、對乙烯基愈創(chuàng)木酚(0.17%)、丁香酚(0.02%)，呈現(xiàn)出特殊芳香、強(qiáng)烈香辛料和發(fā)酵似香氣以及濃郁石竹麝香[26]，雖相對含量較低，但由于其香氣閾值較低，對醋品香氣貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸發(fā)酵條件，并對這2種醋品進(jìn)行指標(biāo)測定及比較研究。優(yōu)化后的紫薯醋酸發(fā)酵條件為發(fā)酵時間11 d、初始酒度7.35%vol、裝液量28%，此條件下，總酸含量為6.92 g/100g。2種發(fā)酵方式同時在其最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵。與紫薯醋相比，紫薯色素回添醋除總糖和維生素含量較低外，其總酸、總酯、總多酚、總黃酮、花青素含量和抗氧化能力均強(qiáng)于紫薯醋且具有顯著性差異(P<0.05)。采用紫薯醋新發(fā)酵工藝可使總多酚、總黃酮、花青素的損失率較傳統(tǒng)發(fā)酵工藝分別降低10.34%、15.61%和42.93%。揮發(fā)性成分分析顯示2種紫薯醋中鑒定出的揮發(fā)性成分的化合物數(shù)量相差較小，種類卻有較大差異。同時，紫薯花青素的提取過程會導(dǎo)致一些對醋品香氣有貢獻(xiàn)的化合物的損失。