于漫涵 董衍鄒 賴州文 唐卓懿 黃藝珠 魯康樂(lè)*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門市飼料檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361061；2.新奧（廈門）農(nóng)牧發(fā)展有限公司，福建廈門361006)

隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖魚類脂肪肝的頻發(fā)成為困擾養(yǎng)殖戶的主要問(wèn)題之一，病魚的肝功能受損，導(dǎo)致生長(zhǎng)下降、免疫低下、抗應(yīng)激能力降低[1-4]，且在遭受病原體侵襲與環(huán)境應(yīng)激時(shí)更易死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開發(fā)緩解脂肪肝的飼料添加劑具有重要的意義。花鱸是一種廣溫廣鹽性的肉食性魚類，在我國(guó)南方地區(qū)大量養(yǎng)殖[5]，由于其生長(zhǎng)迅速，肉質(zhì)細(xì)嫩，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，2018 年花鱸在我國(guó)的年產(chǎn)量已達(dá)16.66 萬(wàn)噸[6]。由于花鱸的腹腔體積較大，使用配合飼料養(yǎng)殖的花鱸常導(dǎo)致脂肪大量沉積，誘發(fā)脂肪肝。

膽汁酸是膽汁的主要成分，具有促進(jìn)脂肪代謝的功能[7-8]。膽汁酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)三酰甘油與膽固醇的代謝維持肝臟的代謝穩(wěn)態(tài)[9-10]。已有研究表明，在齊口裂腹魚飼料中添加膽汁酸能夠提高脂肪代謝酶活性，減少脂肪沉積[11-12]；在大口黑鱸飼料中添加適量膽汁酸能夠提高生長(zhǎng)性能，促進(jìn)脂肪代謝[13-14]；在飼料中添加膽汁酸能夠提高黑鯛的抗氧化能力、脂肪酸β氧化與免疫機(jī)能[15]；在大黃魚飼料中添加膽汁酸能夠提高脂肪代謝與抗氧化酶活性，減少肝臟脂肪沉積并提高生長(zhǎng)性能[16]。乳化膽汁酸是采用特殊工藝技術(shù)，將膽汁酸與油脂乳化制成腸絨毛膜易識(shí)別和吸收的體外乳糜微粒，更利于膽汁酸發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)以花鱸為研究對(duì)象，在飼料中添加不同類型的膽汁酸，研究對(duì)其生長(zhǎng)與脂肪代謝的影響，以期為膽汁酸在花鱸配合飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

根據(jù)花鱸的營(yíng)養(yǎng)需求特點(diǎn)，以魚粉、豆粕、雞肉粉為蛋白源，以魚油、豆油為脂肪源配制蛋白水平為44%，脂肪水平為10%的飼料，分別加入膽汁酸及乳化膽汁酸。各組飼料配方見表1。

各飼料原料經(jīng)過(guò)粉碎并過(guò)60目篩后按配方準(zhǔn)確稱量，然后逐步充分混勻，加水后制成1.5 mm 與2.5 mm 粒徑的顆粒料，于55 ℃烘箱中風(fēng)干5 h 后，用自封袋分裝后于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚與飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用魚購(gòu)自漳州一家苗種場(chǎng)，將魚苗運(yùn)至集美大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場(chǎng)后暫養(yǎng)于體積為1 000 L 養(yǎng)殖桶，使用商品飼料馴養(yǎng)一個(gè)月。待魚苗適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件后，挑選240尾體格健壯、形態(tài)均一、體重約為（2.50±0.02）g的花鱸，隨機(jī)分到12 個(gè)水族缸中，每缸20 尾魚。分別用3 種飼料投喂花鱸，每種飼料設(shè)4 個(gè)重復(fù)，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周。每日定時(shí)飽食投喂三次（8:00、13:00、18:00），并適量換水確保水質(zhì)良好，實(shí)驗(yàn)期間記錄每個(gè)實(shí)驗(yàn)缸的攝食量。水溫25～28 ℃，溶解氧≥6.0 mg/L，氨氮＜0.1 mg/L，pH 7.5～8.5。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方與主要營(yíng)養(yǎng)水平(%)

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，饑餓處理24 h，分別稱量魚體的重量用于計(jì)算增重率等指標(biāo)。每缸隨機(jī)取3 尾魚于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于測(cè)定全魚體成分；取3 尾魚麻醉（丁香酚1：10 000）后尾靜脈取血，取出的血液于4 ℃冰箱中靜置12 h 后，離心后取上層血清存于-80 ℃冰箱中待用。每缸取5 尾魚稱量體重和體長(zhǎng)，解剖分離肝臟、腹脂、胴體分別稱重，以計(jì)算形體指標(biāo)，取背鰭以下側(cè)線以上肌肉，存于-20 ℃冰箱用作肌肉組成分析；取6 尾魚解剖取肝臟，其中3 尾魚的肝臟取出后迅速裝入凍存管，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，另3 尾魚的肝臟固定于Bouin's 液中，保存于4 ℃冰箱。

1.4 樣品分析

花鱸的全魚與肌肉的水分、粗脂肪、粗灰分測(cè)定參考AOAC[17]的方法，水分采用105℃烘箱干燥法測(cè)定，粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定，以乙醚為溶劑，粗灰分采用550 ℃馬弗爐灼燒法測(cè)定，粗蛋白采用杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定。

血清溶菌酶(LZM)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性，血清與肝臟三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)含量、肝臟脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)、脂肪酸合成酶(FASN)活性均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定，具體步驟參考說(shuō)明書。

肝臟組織切片制備：將花鱸肝臟從固定液取出→切成0.5 cm×0.3 cm×0.3 cm大小的組織塊→于50%酒精中靜置6 h→脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→切片機(jī)切片→脫蠟后用HE染液染色→中性樹脂封片制成永久切片→用顯微鏡觀察、拍照。

1.5 計(jì)算公式與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

增重率(%)=（末體重-初體重）/初體重×100

蛋白質(zhì)效率=（末體重-初體重）/蛋白質(zhì)攝入量

肥滿度(g/cm3)=體重(g)/[體長(zhǎng)(cm)]3×100

腹脂率(%)=腹腔脂肪重/體重量×100

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同膽汁酸對(duì)花鱸生長(zhǎng)的影響(見表2)

表2 不同膽汁酸對(duì)花鱸生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，與對(duì)照組相比，乳化膽汁酸提高了花鱸的增重率與攝食量（P＜0.05）。各組間的餌料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率、肝體比、肥滿度、胴體率與腹脂率均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 不同膽汁酸對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)的影響(見表3)

表3 不同膽汁酸對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，膽汁酸與乳化膽汁酸對(duì)溶菌酶和酸性磷酸酶無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，添加膽汁酸與乳化膽汁酸均顯著降低了ALT和AST的活性（P＜0.05），并顯著提高了TC含量（P＜0.05）。膽汁酸與乳化膽汁酸使TG 含量略有升高，但差異不顯著（P＞0.05）。乳化膽汁酸顯著提高了AKP活性（P＜0.05）。

2.3 不同膽汁酸對(duì)花鱸全魚與肌肉組成的影響（見表4）

由表4可知，各組花鱸全魚的水分、粗蛋白、粗灰分無(wú)顯著差異（P＞0.05），添加膽汁酸與乳化膽汁酸對(duì)肌肉水分、粗蛋白、粗灰分無(wú)顯著影響（P＞0.05），膽汁酸顯著降低了肌肉的粗脂肪水平（P＜0.05），而乳化膽汁酸則對(duì)肌肉粗脂肪含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表4 不同膽汁酸對(duì)花鱸全魚與肌肉組成的影響（%）

2.4 不同膽汁酸對(duì)花鱸肝臟脂肪代謝的影響(見表5)

表5 不同膽汁酸對(duì)花鱸肝臟脂肪代謝的影響

由表5 可知，與對(duì)照組相比，膽汁酸與乳化膽汁酸均顯著提高了脂蛋白脂酶和總脂酶的活性（P＜0.05）、顯著降低了三酰甘油的含量（P＜0.05）。各組間肝脂酶、脂肪酸合成酶活性，總膽固醇含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 不同膽汁酸對(duì)花鱸肝臟組織學(xué)的影響(見圖1)

圖1 不同膽汁酸對(duì)花鱸肝臟組織學(xué)的影響

如圖1 所示，各組細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的空泡化、細(xì)胞核偏移等異?，F(xiàn)象，但膽汁酸組與乳化膽汁酸組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加緊密。

3 討論

膽汁酸作為一種安全高效的飼料添加劑，已在多種水產(chǎn)動(dòng)物中開展了廣泛的研究[15]。大量研究表明膽汁酸對(duì)魚類的生長(zhǎng)有顯著的影響，Ding等[16]在大黃魚高脂飼料中添加膽汁酸，顯著提高了增重率和蛋白質(zhì)效率；Zhou 等[18]的研究表明，在草魚飼料中添加膽汁酸，能夠提高特定生長(zhǎng)率和飼料效率；向梟等[12]在齊口裂腹魚高脂飼料中添加膽汁酸，顯著提高了增重率和蛋白質(zhì)效率，且降低了飼料系數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，乳化膽汁酸是采用特殊工藝技術(shù)將膽汁酸與油脂乳化制成腸絨毛膜易識(shí)別和吸收的乳糜微粒狀。經(jīng)過(guò)8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，乳化膽汁酸提高了花鱸的增重率，且顯著提高了攝食量；然而添加未經(jīng)乳化處理的膽汁酸則對(duì)生長(zhǎng)沒有顯著的影響。這表明：經(jīng)乳化后的膽汁酸產(chǎn)品因產(chǎn)品均勻度好，更利于其發(fā)揮功效。乳化膽汁酸對(duì)花鱸的促生長(zhǎng)作用的機(jī)制，可能是其提高了魚體對(duì)脂肪的消化吸收；乳化膽汁酸呈微粒狀，可擴(kuò)大與脂肪的接觸面積；此外，乳化膽汁酸提高了魚體的攝食量，也表明其對(duì)消化有改善作用，這些原因?qū)е氯榛懼峤M的增重率顯著提高。

溶菌酶是魚類天然免疫系統(tǒng)中的重要組成，其活性能夠反映魚體的免疫機(jī)能[19]。Jin等[15]的研究表明，飼料中添加膽汁酸提高了黑鯛的肝臟溶菌酶活性，從而改善了黑鯛的免疫力。Guo等[20]在大口黑鱸的飼料中添加膽汁酸，顯著提高了其血清溶菌酶的活性。本實(shí)驗(yàn)中，花鱸的血清溶菌酶活性無(wú)顯著的差異，這表明膽汁酸對(duì)于魚體免疫的作用還需進(jìn)一步的研究。

谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶在血清的含量能夠反映肝臟的健康狀況[21]。本實(shí)驗(yàn)中，膽汁酸與乳化膽汁酸均顯著降低了這兩種酶的活性，表明膽汁酸可以維護(hù)肝臟健康。堿性磷酸酶能催化核苷酸、蛋白質(zhì)、生物堿等多種分子去磷酸化，可間接反映魚體的健康狀況[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中，乳化膽汁酸顯著提高了花鱸血清堿性磷酸酶的活性，表明乳化膽汁酸能夠促進(jìn)花鱸的健康。

血脂含量可以反映脂肪的代謝情況，膽汁酸與乳化膽汁酸均提高了三酰甘油和膽固醇的含量，這表明促進(jìn)了肝脂向肝外組織的轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于緩解魚體的脂肪肝發(fā)生。此外，肝脂酶與脂蛋白脂酶是脂肪代謝的重要酶，其活性是評(píng)估脂肪分解代謝的主要指標(biāo)之一[24]。本實(shí)驗(yàn)中，膽汁酸與乳化膽汁酸均顯著提高了肝臟肝脂酶與脂蛋白脂酶的活性，且肝臟三酰甘油的含量也顯著地降低了，這表明肝臟脂肪分解加強(qiáng)。因此，膽汁酸對(duì)于預(yù)防或緩解魚類脂肪肝有非常好的效果。

本實(shí)驗(yàn)表明，飼料中添加乳化膽汁酸能顯著促進(jìn)花鱸的生長(zhǎng)、提高脂肪分解能力而降低肝臟脂肪沉積，維持肝臟的健康。