裴朝東

（廣西工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530008）

我國(guó)飼料工業(yè)經(jīng)過(guò)多年的快速發(fā)展，逐步形成了飼料添加劑及配合飼料等系列產(chǎn)品，為發(fā)展現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)提供了有力支撐。但隨之而來(lái)的是抗生素的大量使用和由養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的日益嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告要求，自2020年1月1日起，將退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種。2020 年，飼料行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)開(kāi)始為禁抗、減抗、替抗做出調(diào)整和改變。與此同時(shí)，枯草芽孢桿菌等34 種微生物和13 種酶制劑可以應(yīng)用到飼料和飼料添加劑等產(chǎn)品中[1]。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）屬于芽孢桿菌屬，大小（寬度×長(zhǎng)度）為（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，屬革蘭氏陽(yáng)性菌[2]。多項(xiàng)研究表明，枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖行業(yè)中的作用非常明顯。鐘光等（2020）向肉雞日糧中添加枯草芽孢桿菌，提高肉雞的免疫力[3]。馮英珍（2020）在仔豬日糧中添加枯草芽孢桿菌和杜仲葉提取物，腹瀉率降低約40%～50%[4]。蔡艷等（2018）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用枯草芽孢桿菌代替抗生素，改善了養(yǎng)殖的水質(zhì)[5]。這些研究均強(qiáng)調(diào)了枯草芽孢桿菌在畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，水分、載體含量大小對(duì)活菌數(shù)的影響存在某種非線性影響。目前關(guān)于對(duì)微生物類混合型飼料添加劑產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)的穩(wěn)定性的研究不多?；谝陨涎芯壳闆r，本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為衡量指標(biāo)，通過(guò)對(duì)產(chǎn)品的水分含量以及噴漿玉米皮、豆粕、黃芪、甘草等組分的分析，研究各因素對(duì)產(chǎn)品的影響情況，為固態(tài)微生物混合型飼料添加劑類產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)的產(chǎn)品穩(wěn)定性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 載體

本試驗(yàn)以噴漿玉米皮、豆粕、黃芪、甘草、石粉為載體，按要求混合而成，各成分均符合《飼料原料目錄》和《飼料添加劑品種目錄》要求。原料經(jīng)粉碎，過(guò)16目和24目標(biāo)準(zhǔn)篩，24目標(biāo)準(zhǔn)篩篩上物少于10%。

1.2 試驗(yàn)菌粉

試驗(yàn)所用的枯草芽孢桿菌，粉狀，來(lái)源于山東蔚藍(lán)生物科技有限公司，活菌數(shù)1 000×108CFU/g。

1.3 基礎(chǔ)組方與測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 試驗(yàn)材料及基礎(chǔ)組方

試驗(yàn)所用的混合型飼料添加劑為枯草芽孢桿菌，以噴漿玉米皮、黃芪、豆粕、甘草等為載體，加入枯草芽孢桿菌混合而成，各成分的組方范圍為：噴漿玉米皮21%～33%、豆粕12%～18%、黃芪5%～14%、甘草3%～12%、枯草芽孢桿菌4%。將載體按組方混合，用快速水分測(cè)定儀初測(cè)水分后，根據(jù)組方對(duì)水分的要求，適當(dāng)調(diào)整水分到該組方的水分，將枯草芽孢桿菌加入，混合均勻，將試樣用自封樣品袋分裝為8 袋，每袋250 g，模擬產(chǎn)品的包裝及保存狀態(tài)，放置72 h 后，開(kāi)始檢測(cè)枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)

測(cè)定樣品中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的含量。

1.3.2.1 菌落計(jì)數(shù)

采用涂布法[6]和平板傾注法[7]相結(jié)合的方法計(jì)數(shù)。

1.3.2.2 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌測(cè)定所用的培養(yǎng)基為NA營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)過(guò)程

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)15.10高級(jí)版中的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，表1為產(chǎn)品穩(wěn)定性影響因素均勻設(shè)計(jì)水平參數(shù)，4水平5因素16處理的均勻設(shè)計(jì)表U16(45)，如表2所示。

表1 產(chǎn)品穩(wěn)定性影響因素均勻設(shè)計(jì)水平參數(shù)

將表1所列的數(shù)據(jù)填入表2中，并按上述1.3.1要求完成分裝和測(cè)定，均勻試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007 進(jìn)行初步整理后，采用SAS9.2軟件建立二次響應(yīng)曲面回歸模型，考察因變量Y（活菌數(shù)）與自變量X1、X2、X3、X4、X5（水分、噴漿玉米皮、豆粕、黃芪、甘草含量）之間的關(guān)系。

2.2.1 回歸模型建立

利用SAS9.2 軟件進(jìn)行二次響應(yīng)曲面的回歸模型建立，其基本思路是，假設(shè)響應(yīng)量（因變量）與自變量（觀測(cè)值）之間滿足某種二次函數(shù)關(guān)系，而且每個(gè)因素（自變量）的測(cè)量觀測(cè)值都測(cè)三個(gè)以上的不同值，則可以通過(guò)最小二乘估計(jì)法來(lái)擬合影響因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系。假定因變量Y在五個(gè)自變量X1、X2、X3、X4、X5 的組合上被測(cè)量，則可得因變量Y 的二次響應(yīng)模型的回歸方程。

Y=β0+β1×X1+β2×X2+β3×X3+β4×X4+β5×X5+β 6×X11+β7×X21+β8X22+β9×X31+β10×X32+β11×X33+β12×X41+β13×X42+β14×X43+β15×X44+β16×X51+β17×X52+β18×X53+β19×X54+β20×X55

表2 產(chǎn)品穩(wěn)定性影響因素均勻設(shè)計(jì)方案

表3 產(chǎn)品穩(wěn)定性影響因素樣品均勻試驗(yàn)結(jié)果

啟動(dòng)SAS9.20 軟件，進(jìn)入Editor 窗口，輸入如圖1所示各語(yǔ)句，用run運(yùn)行后，得到SAS數(shù)據(jù)集。

它包含6 個(gè)變量，其中Y 代表樣品中的活菌數(shù)；X1 代表樣品中水分的含量；X2 代表噴漿玉米皮含量（%）；X3 代表豆粕含量（%）；X4 代表黃芪含量（%）；X5 代表甘草含量（%）。根據(jù)SAS 語(yǔ)法規(guī)則，model 語(yǔ)句中，必須先對(duì)變量X1、X2、X3、X4、X5 用sort 排 序，在RSREG 方法 中，選 擇lackfit 選項(xiàng)進(jìn) 行二次響應(yīng)回歸分析。輸出結(jié)果如圖2、圖3、圖4、圖5 所示。

2.2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.2.1 模型優(yōu)化

根據(jù)式2.2.1節(jié)二次響應(yīng)模型的回歸方程所列各系數(shù)分布情況，結(jié)合圖5回歸模型的各系數(shù)，排除響應(yīng)不顯著4 個(gè)值X5、X31、X31、X41，以及系數(shù)為0 的值，得到樣品中活菌數(shù)的二次響應(yīng)回歸模型的方程。

2.2.2.2 曲面響應(yīng)分析

從圖3所示可以看出，模型的二次響應(yīng)曲面的穩(wěn)定點(diǎn)是一個(gè)鞍點(diǎn)（saddle point），并且在同一個(gè)平面內(nèi)，穩(wěn)定點(diǎn)的值是62.960 330，五個(gè)因素的穩(wěn)定點(diǎn)坐標(biāo)分別為X1=18.133 187，X2=28.248 542；X3=16.813 337；X4=5.720 995；X5=4.500 000，因此，可通過(guò)優(yōu)化模型中的五個(gè)影響因素（X1、X2、X3、X4、X5）的值，特定條件下通過(guò)分析樣品中的活菌數(shù)變化情況，最大程度優(yōu)化五個(gè)影響因素對(duì)活菌數(shù)的影響情況，但無(wú)法通過(guò)優(yōu)化讓活菌數(shù)達(dá)到最大值或最小值。

圖1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的SAS程序及說(shuō)明

圖2 最佳響應(yīng)面輸出結(jié)果

從圖2最佳響應(yīng)輸出結(jié)果來(lái)看，二次響應(yīng)曲面回歸模型是顯著的（總的顯著概率為Pr＞F=0.01,該值小于0.05為顯著），線性項(xiàng)（Pr＞F=0.006 1）和二次項(xiàng)（Pr＞F=0.017 2）是顯著的。模型總的決定系數(shù)為R2=1.000 0，其中二次項(xiàng)和線性決定系數(shù)分別為0.063 1和0.895 1。

從圖4各因素對(duì)結(jié)果響應(yīng)的顯著程度來(lái)看，各因素的響應(yīng)程度分別為:X1(Pr＞F=0.011 2)＞X4(Pr＞F=0.027 4)＞X3(Pr＞F=0.032 3)＞X2(Pr＞F=0.036 3)＞X5(Pr＞F=0.186 8)，這就意味著，在五個(gè)影響因素中，水分含量的高低對(duì)樣品中的活菌數(shù)的影響最大，其次是黃芪、豆粕的含量大??；甘草的含量多少對(duì)樣品的活菌數(shù)影響不大。

3 試驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)利用SAS 軟件進(jìn)行二次曲面響應(yīng)回歸模型的構(gòu)建與分析，得到以下結(jié)論。

①以噴漿玉米皮、豆粕、黃芪、甘草等為載體，以枯草芽孢桿菌為主要成分的固體微生物混合型飼料添加劑，在產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)，各因素對(duì)樣品活菌數(shù)的影響呈二次曲面響應(yīng)狀態(tài)，符合二次響應(yīng)曲面模式。

②在5個(gè)影響因素中，水分的高低是主要的影響因素，其次是黃芪含量的大小，因此，以上述所列成分為載體的固態(tài)微生物混合型飼料添加劑產(chǎn)品，在保質(zhì)期內(nèi)要嚴(yán)格控制產(chǎn)品的水分，才能保證產(chǎn)品的效果。

圖3 響應(yīng)曲面的特征向量值

圖4 各因素對(duì)結(jié)果響應(yīng)的顯著程度

③樣品中的水分超過(guò)18.13%、噴漿玉米皮含量超過(guò)28.25%、豆粕超過(guò)16.81%，則產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)的穩(wěn)定性則不可預(yù)測(cè)，變得更不易保存。

4 討論

固態(tài)微生物混合型飼料添加劑在保質(zhì)期內(nèi)水分是影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)反映了載體的水分高低、黃芪等組分含量的大小等因素對(duì)產(chǎn)品中枯草芽孢桿菌活性的影響程度，其可能的影響機(jī)理包括以下幾種。

①水分是主要影響因素，本試驗(yàn)研究表明，產(chǎn)品水分超過(guò)18.13%，則變成不穩(wěn)定因素?？莶菅挎邨U菌為好氧菌，在其繁殖過(guò)程中，產(chǎn)芽孢的多少是衡量其活性的重要指標(biāo)，芽孢的形成受營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境的雙重調(diào)控[8]。在真空或包裝中，枯草芽孢桿菌繁殖過(guò)程需要的氧，一方面來(lái)自包裝袋中留存的氧氣，另一方面來(lái)源載體水分中的游離氧，這種好氧發(fā)酵的過(guò)程非常復(fù)雜，一方面枯草芽孢發(fā)酵過(guò)程能充分利用包裝袋中的氧分子及載體水分中的游離氧，但水分太高，水分中的雜質(zhì)、雜菌等對(duì)芽孢的繁殖過(guò)程又產(chǎn)生了相應(yīng)的抑制作用，其影響機(jī)理有等進(jìn)一步研究。

②本試驗(yàn)中，黃芪及甘草等載體含量對(duì)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響，主要作用機(jī)理尚不明確，一般研究理論認(rèn)為，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的纖維素酶能破壞中藥的細(xì)胞壁，使黃芪多糖、甘草類黃酮等中藥有效成分充分釋放出來(lái)，有效提高中藥的藥效和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9]。但黃芪多糖、甘草類黃酮等中藥成分又具有一定的抑菌作用，盡管這種抑菌作用一般研究認(rèn)為是對(duì)有害菌繁殖的抑制，但濃度達(dá)到一定量后，是否也對(duì)枯草芽孢桿菌的繁殖有一定的抑制作用，有待進(jìn)行深入研究。

圖5 回歸模型的系數(shù)

③噴槳玉米皮含量對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響可能與其特有的加工工藝及其易產(chǎn)生真菌毒素有關(guān)。根據(jù)《飼料原料目錄》中對(duì)噴槳玉米皮的定義，噴槳玉米皮是玉米經(jīng)浸泡液浸泡后干燥粉碎而成，其含有的糖分為枯草芽孢桿菌的發(fā)酵提供了部分碳源，但玉米在水分及溫度適宜的情況下極易產(chǎn)生真菌毒素，真菌毒素含量的升高，打亂了枯草芽孢桿菌繁殖過(guò)程中的平衡，從而抑制枯草芽孢桿菌的繁殖，其詳細(xì)的作用機(jī)理有等進(jìn)一步深入研究。

④豆粕等載體含量對(duì)活菌數(shù)的影響尚不清晰，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。