郭俊愷 趙承磊 趙興旺 王 娟 葛 蘭 宋志強 游 弋

陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶，400038

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome, SS)是一種慢性自身免疫性疾病，中年女性好發(fā)，發(fā)病率為0.1%～0.6%[1,2]。其臨床表現(xiàn)可分為兩類：外分泌腺表現(xiàn)和腺體外表現(xiàn)。外分泌腺主要累及淚腺和唾液腺，常引起眼、口干燥。腺體外可累及皮膚、關(guān)節(jié)、肺、胃、腎等臟器[3,4]。SS的病因目前尚不明確，可能與遺傳和環(huán)境因素的復雜相互作用有關(guān)，目前認為SS與自身抗原Ro/SSA和La/SSB導致的異常免疫反應(yīng)有關(guān)[5-7]。

隨著高通量測序和微陣列技術(shù)的發(fā)展，生物信息學已用于篩選各種疾病中的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)[8]。為了深入探討SS的發(fā)病機制，本研究對基因數(shù)據(jù)庫中下載的GSE23117和GSE127952的基因表達譜進行了分析，鑒定關(guān)鍵DEGs，分析它們在SS發(fā)病過程中的潛在途徑，為研究SS的發(fā)生和發(fā)展提供一些新的思路。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)信息 從基因數(shù)據(jù)庫(NCBI-GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得GSE23117和GSE127952的基因表達譜。GSE23117的數(shù)據(jù)來自GPL570平臺[Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]的芯片，用于研究SS和非SS患者不同炎癥程度的小唾液腺的基因表達，我們分析其中10個SS小唾液腺標本和4個健康對照小唾液腺樣本；GSE127952來自GPL20995平臺[Agilent-019415 Human and Custom Viral Transcript Array 1.2]的芯片，用于研究SS患者和健康志愿者在小唾液腺中基因表達譜的差異，包括8個SS小唾液腺樣本和6個健康對照小唾液腺樣本。NCBI-GEO屬于國際公共公開的基因表達數(shù)據(jù)庫，用于幫助科研工作者們查詢和下載實驗以及精選的基因表達譜。

1.2 DEGs的數(shù)據(jù)提取 SS和健康對照腺體樣本的DEGs均來自GEO2R網(wǎng)站，取|logFC|>2，P值<0.05。logFC>2的DEGs被視為上調(diào)基因，而logFC<-2的DEGs被視為下調(diào)基因。用Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選出GSE23117和GSE127952中共同的上調(diào)和下調(diào)DEGs，并用Heml 1.0軟件分別繪制GSE23117和GSE127952共同DEGs的熱圖。

1.3 PPI圖譜和關(guān)鍵基因的獲取 使用在線工具STRING (https://string-db.org/)用于評估PPI網(wǎng)絡(luò)信息。然后通過下載Cytoscape軟件研究DEGs之間的潛在關(guān)系，利用Cytoscape軟件的MCODE(Degree Cutoff=2，Max. Depth=100, K-Core=2, Node Score cutoff=0.2)應(yīng)用程序來獲得關(guān)鍵的候選基因。最后應(yīng)用David Gene(http://david.abcc.ncifcrf.gov)功能分類工具分析GO和KEGG途徑。

2 結(jié)果

2.1 SS小唾液腺樣本中DEGs的鑒定 在這項研究中，我們分別對GSE23117(10個SS小唾液腺樣本和4個健康對照小唾液腺樣本)和GSE127952(8個SS小唾液腺樣本和6個健康對照小唾液腺樣本)的數(shù)據(jù)集進行了分析。通過GEO2R在線工具，我們分別從GSE23117和GSE127952中提取了658和155個DEGs。利用Venn圖分析了31個重疊的DEGs，這些重疊基因包括28個上調(diào)基因和3個下調(diào)基因，并用Heml 1.0軟件繪制重疊DEGs熱圖(表1，圖1、2)。

縱軸代表基因，橫軸中SS為病例組，HC為對照組

表1 重疊的DEGs

2.2 功能和途徑的基因分析 使用David軟件探索31個DEGs的功能和途徑。功能分析的結(jié)果表明，在生物學過程(BP)中，上調(diào)的DEGs在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、白細胞趨化性正向調(diào)節(jié)、趨化因子介導的信號通路、細胞-細胞信號傳導、cAMP代謝過程正向調(diào)節(jié)、cAMP介導的信號傳遞正向調(diào)節(jié)、細胞增殖調(diào)節(jié)和干擾素-γ負向調(diào)節(jié)中聚集。在細胞成分(CC)分析中，上調(diào)的DEGs聚集在質(zhì)膜的外部和細胞外區(qū)域。在分子功能(MF)分析中，上調(diào)的DEGs在絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結(jié)合中富集(表2)。

表2 干燥綜合征功能的基因分析

2.3 KEGG分析的結(jié)果 分析結(jié)果提示在細胞因子-細胞因子受體相互作用，趨化因子信號傳導途徑，阿米巴病和白細胞跨內(nèi)皮遷移等通路明顯富集(表3)。

表3 干燥綜合征差異表達基因的KEGG分析

2.4 PPI和模塊化圖片 建立DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。使用Cytoscape軟件MCODE應(yīng)用程序來顯示9個中心節(jié)點(CXCL9，CXCL11，CXCL13，CCR1，CD69，PTPRC，GPR183，MMP9和IL10)的結(jié)果(圖4)。

圓圈代表基因，線代表基因之間的PPI，圓圈內(nèi)的結(jié)果代表蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

方塊代表基因，結(jié)果顯示9個關(guān)鍵基因

3 討論

在本研究中，對BP的GO功能分析顯示，上調(diào)的DEGs主要集中在炎癥、免疫、對脂多糖(LPS)的反應(yīng)、白細胞趨化性的正調(diào)節(jié)和趨化因子介導的信號通路等方面。SS是一種與炎癥介質(zhì)、細胞浸潤密切相關(guān)的自身免疫性疾病[9]。既往研究中LPS刺激唾液細胞可上調(diào)TLR 4的表達和免疫調(diào)節(jié)分子的表達，這在SS的唾液腺炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[10]。SS患者唾液中細胞因子/趨化因子的濃度明顯高于對照組[11]。這與我們分析的結(jié)果類似。CC分析中，DEGs主要集中在細胞質(zhì)膜外區(qū)域和細胞外間隙。MF分析中，絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、趨化因子活性和CXCR趨化因子受體結(jié)合中富集。KEGG分析提示DEGs通路與細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移和阿米巴病有關(guān)。SS發(fā)病機制的研究表明，T淋巴細胞和B淋巴細胞對自身抗原的異常反應(yīng)導致細胞因子和趨化因子水平升高，引起腺泡慢性炎癥并最終導致其生理功能的喪失[7]。阿米巴滋養(yǎng)體可以誘導IL-10的產(chǎn)生[12]。IL-10的表達在抵抗阿米巴病侵襲的黏膜屏障中發(fā)揮重要的作用[13]。同時作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的抗炎細胞因子，IL-10在SS患者的唾液腺中高表達,通過釋放免疫介質(zhì)和抗原呈遞來抑制單核細胞和巨噬細胞的免疫功能[14,15]。

PPI和模塊分析表明，CXCL9、CXCL11、CXCL13、CCR1、CD69、PTPRC、GPR183、MMP9和IL10基因顯著富集。這9個關(guān)鍵基因主要可以分為三大類：一是細胞因子及趨化因子基因，包括IL10、CXCL9、CXCL11、CXCL13、CCR1。IL10作為重要的抗炎細胞因子，在自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[16]，IL-10的rs3024505變體是干燥綜合征的易感等位基因[17]。CXCL9、CXCL11、CXCL13屬于趨化因子配體家族，在SS患者唾液中濃度高出正常人，提示與唾液腺的大量淋巴細胞聚集密切相關(guān)[11]。CCR1是一種趨化因子受體，與細胞浸潤、活化、組織損傷和炎癥有關(guān)。SS患者B淋巴細胞中CCR1的表達上調(diào)，可能與B淋巴細胞的干擾素信號有關(guān)[18]。在KEGG分析中，我們發(fā)現(xiàn)IL10、CXCL9、CXCL11、CXCL13和CCR1主要參與細胞因子與胞嘧啶受體的相互作用和趨化因子信號通路，這可能提示趨化因子在SS中的異常表達使外分泌細胞浸潤，導致外分泌腺功能障礙[19]。二是免疫相關(guān)基因，包括CD69，MMP9。CD69是II型跨膜糖蛋白，與其交聯(lián)可產(chǎn)生細胞內(nèi)信號傳導及多種免疫反應(yīng)，與血液系統(tǒng)疾病及免疫性相關(guān)疾病的發(fā)病機理有關(guān)。SS患者中活化的CD3/CD69T細胞百分比增加，在組織的炎性級聯(lián)中起重要作用[20]。MMP9也稱為明膠酶B，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族。MMP9基因被證明與自身免疫的病理生理過程有關(guān)[21]。MMP9的增加或許與唾液腺結(jié)構(gòu)完整性的退化有關(guān)，導致唾液生成減少[22]。三是其它基因，包括PTPRC，GPR183。PTPRC的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成員，在細胞生長、分化、有絲分裂和致癌轉(zhuǎn)化中起著重要作用[23]。PTPRC基因與SS有關(guān)，可能參與基因甲基化[24]。GPR183又稱EB病毒誘導分子2(EBI 2)，GPR183主要在B細胞中表達并誘導細胞遷移和增殖[25]。在SS患者腺上皮曾發(fā)現(xiàn)EB病毒顆粒,在SS患者血清中也發(fā)現(xiàn)過EB病毒抗體[26]。我們的研究一定程度上支持病毒感染可能是SS的激發(fā)因素。

綜上所述，DEGs主要通過細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路等調(diào)控炎癥、免疫參與SS的發(fā)病機制。我們推測篩選的9個關(guān)鍵DEGs在SS的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，可能為研究SS的表面靶點和生物學機制提供一些新思路和方向。