(浙江司太立制藥股份有限公司,臺州 317300)

碘普羅胺(Iopromide)化學(xué)名為N,N′-雙(2,3-二羥基丙基)-2,4,6-三碘-5-[(2-甲氧基)乙酰胺基]-N′-甲基-1,3-苯二甲酰胺,是一種非離子型碘造影劑的化學(xué)活性物質(zhì)(API),是德國先靈(Schering)公司的原研藥[1-2]。由于碘普羅胺的合成過程引入了雜原子氮,可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)式如圖1的雜質(zhì)1～5,需對其含量進(jìn)行嚴(yán)格控制[5]。歐洲藥典[3]和美國藥典[4]中的碘普羅胺專論對雜質(zhì)1～5含量的測定方法為薄層色譜法(TLC),但文獻(xiàn)中還未發(fā)現(xiàn)涉及碘普羅胺中雜質(zhì)分析的報(bào)道。

為了克服TLC的專屬性及靈敏度較低、操作繁瑣、重現(xiàn)性較差等缺陷,本工作提出了高效液相色譜法(HPLC)測定碘普羅胺中的雜質(zhì)1～5含量的方法,以期為碘普羅胺相關(guān)產(chǎn)品中雜質(zhì)含量的控制提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo U3000型高效液相色譜儀,配多元泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器和二極管陣列檢測器。

雜質(zhì)1 對照品:批號WS-1501-1,純度不小于98%。

雜質(zhì)2對照品:批號2188-015A9,純度不小于98%。

雜質(zhì)3 對照品:批號WS-1301-1,純度不小于97%。

雜質(zhì)4 對照品:批號WS-1301-1,純度不小于97%。

雜質(zhì)5 對照品:批號2120-070A2,純度大于98%。

乙腈和2-丁醇為色譜純,使用前經(jīng)過0.2μm 濾膜過濾;試驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q 再次純化的純水;試驗(yàn)所用樣品(批號C025-160800)由浙江司太立制藥股份有限公司提供。

雜質(zhì)4～5標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:稱取適量雜質(zhì)4和雜質(zhì)5對照品,加水溶解并稀釋,制成1 g·L－1雜質(zhì)4和雜質(zhì)5單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合對照品儲備溶液:稱取適量雜質(zhì)1～3的對照品,取雜質(zhì)4標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液10 mL和雜質(zhì)5儲備溶液5 mL 于同一小燒杯中,用水溶解后,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,配制成雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4 合雜質(zhì)5 質(zhì)量濃度分別為0.25,0.50,0.25,0.10,0.05 g·L－1混合對照品儲備溶液。

圖1 雜質(zhì)1～5的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of impurities of 1－5

混合對照品溶液:取混合對照品儲備溶液2.0 mL于20 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,配制成雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4、雜質(zhì)5的質(zhì)量濃度分別為0.025,0.050,0.025,0.010,0.005 g·L－1的混合對照品溶液。

系統(tǒng)適用性溶液:稱取適量雜質(zhì)1和雜質(zhì)3,加水溶解并稀釋,配制成2.5 mg·L－1的系統(tǒng)適用性溶液。

1.2 色譜條件

Eclipse C18Plus色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫35 ℃;流量1.0 mL·min－1;紫外檢測波長245 nm;進(jìn)樣量10μL;流動相:A 為水,B為體積比為55∶40∶5的水-乙腈-2-丁醇混合溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取碘普羅胺樣品50 mg,加水溶解并定容至10.0 mL,按照儀器工作條件測定其中雜質(zhì)1～5的含量。

1.4 外標(biāo)法峰面積的計(jì)算方法

雜質(zhì)1的峰面積為雜質(zhì)1的兩個(gè)主峰面積之和,即S1＝S1A＋S2B;雜質(zhì)2的峰面積為雜質(zhì)2第1個(gè)主峰面積除以46%,即S2＝S2A/46%;雜質(zhì)3的峰面積為雜質(zhì)3 的兩個(gè)主峰面積之和,鄧S3＝S3A＋S3B;雜質(zhì)4的峰面積為雜質(zhì)4第5個(gè)主峰面積除以25%,即S4＝S4E/25%;雜質(zhì)5峰面積為雜質(zhì)4第1個(gè)主峰與雜質(zhì)5第2個(gè)主峰的重疊峰的峰面積與雜質(zhì)4第5個(gè)主峰峰面積之差除以25%,即S5＝(S4A∩S5B－S4E)/25%。其中,S為峰面積,A～E為雜質(zhì)主峰對應(yīng)的順序編號。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的專屬性考察

按照試驗(yàn)方法對系統(tǒng)適用性溶液、混合對照品溶液和加標(biāo)樣品溶液(加標(biāo)量0.01 g·L－1)進(jìn)行測定,結(jié)果見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液、混合對照品溶液和加標(biāo)樣品溶液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of system suitability solution,mixed reference solution and spiked sample solution

由圖2可知,雜質(zhì)1和雜質(zhì)3可有效分離,分離度為35,雜質(zhì)峰和碘普羅胺峰能完全分離,每個(gè)雜質(zhì)主峰間的面積比例相對穩(wěn)定。雜質(zhì)1,2,3,5和碘普羅胺均有2個(gè)主峰,雜質(zhì)4有5個(gè)主峰,雜質(zhì)1和雜質(zhì)3的主峰不與其他雜質(zhì)峰重疊,可以直接進(jìn)行測定;雜質(zhì)2的第2主峰與雜質(zhì)5的第1主峰完全重疊,雜質(zhì)4第1主峰與雜質(zhì)5的第2主峰重疊,因此,雜質(zhì)2,4,5應(yīng)按照1.4節(jié)外標(biāo)法峰面積的計(jì)算方法進(jìn)行定量。

2.2 檢測波長的選擇

按照儀器工作條件對加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行紫外掃描,得到碘普羅胺、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4和雜質(zhì)5的紫外吸收圖譜見圖3。

圖3 碘普羅胺和雜質(zhì)1～5的紫外圖譜Fig.3 UV spectra of iopromide and impurities of 1－5

碘普羅胺及雜質(zhì)1～5的最大吸收峰分別位于 241.0,242.8,245.6,243.9,243.2,242.0 nm 處,由于國家藥品審評中心的碘美普爾標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號JX20050001)建議此類雜質(zhì)的檢測波長為245 nm,故確定檢測波長為245 nm。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

因?yàn)镋clipse C18Plus色譜柱對具有相似結(jié)構(gòu)的化合物具有良好的分離效果,因此,試驗(yàn)采用Eclipse C18Plus色譜柱對系統(tǒng)適用性溶液和加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行測定。結(jié)果顯示:雜質(zhì)1和雜質(zhì)3的分離度大于20,加標(biāo)樣品溶液試驗(yàn)中各雜質(zhì)均有良好的分離。故試驗(yàn)選擇Eclipse C18Plus色譜柱作為分離柱。

2.3.2 柱 溫

試驗(yàn)考察了柱溫分別為33,35,37 ℃時(shí)對系統(tǒng)適用性溶液及加標(biāo)樣品溶液中各雜質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)柱溫為33℃和35℃時(shí),各雜質(zhì)的分離度均好于柱溫為37℃時(shí)各雜質(zhì)的分離度,由于35 ℃時(shí)的峰形較好,故將柱溫確定為35 ℃。

2.3.3 流動相B中2-丁醇體積分?jǐn)?shù)

根據(jù)國家藥品審評中心的碘美普爾標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號JX20050001),適量的2-丁醇有利于雜質(zhì)的分離,故試驗(yàn)考察了流動相B 中2-丁醇的體積分?jǐn)?shù)分別為3%～5%時(shí)對雜質(zhì)1兩個(gè)主峰分離效果的影響。結(jié)果顯示:2-丁醇的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí),雜質(zhì)1的兩個(gè)主峰分離效果良好,體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí),雜質(zhì)1的兩個(gè)主峰合并成了一個(gè)主峰,分離效果最差。故試驗(yàn)選擇流動相B中2-丁醇的體積分?jǐn)?shù)為5%。

2.3.4 流動相的流量

試驗(yàn)考察了流動相的流量分別為0.8,1.0,1.2 mL·min－1時(shí)對雜質(zhì)分離效果的影響,結(jié)果顯示:流量為1.0 mL·min－1時(shí),雜質(zhì)1～5分離效果較理想。故試驗(yàn)選擇流動相的流量為1.0 mL·min－1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

取適量混合對照品儲備溶液,用水逐級稀釋配制成質(zhì)量濃度為碘普羅胺中雜質(zhì)1～5限值[3](分別為25.7,50.5,25.6,10.1,5.1 mg·L－1)10%,50%,100%,150%,200%等5個(gè)系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照儀器工作條件測定,以各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)峰面積(按照1.4節(jié)方法計(jì)算)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),所得檢出限的計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.5 重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)

在50 mL容量瓶中加入50 mg樣品和1 mL混合對照品儲備溶液配制加標(biāo)樣品溶液,平行制備6份,按照儀器工作條件對其進(jìn)行測定,得到雜質(zhì)1～5測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.7%,6.4%,9.5%,2.6%,2.4%。

由第二人在不同高效液相色譜儀上按照同樣的儀器工作條件對上述溶液進(jìn)行測定,得到雜質(zhì)1～5測定值的RSD 分別為7.2%,0.55%,1.1%,0.32%,0.20%。

由以上結(jié)果可知,雜質(zhì)1～5 測定值的RSD(n＝6)均在國家藥品審評中心建議的15%以內(nèi)[8]。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照儀器工作條件對分別放置0,12,17,26,32 h后的加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行測定,得到雜質(zhì)1～5在32 h內(nèi)的測定值的RSD 分別為0.66%,0.67%,4.3%,0.87%%,0.22%說明樣 品溶液 的穩(wěn)定 性較好。

2.7 回收試驗(yàn)

對樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平(加標(biāo)量分別相當(dāng)于雜質(zhì)1～5限值的50%,100%,150%)的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行配制3份,按照儀器工作條件測定。計(jì)算得到雜質(zhì)1～5的回收率分別為105%,93.7%,95.2%,97.8%,112%。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行分析,檢出了雜質(zhì)1和雜質(zhì)2,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.038%,0.19%。

本工作采用高效液相色譜法對碘普羅胺API中的雜質(zhì)1～5的含量進(jìn)行了測定,該方法前處理簡單、回收率高、重現(xiàn)性好,可用于碘普羅胺雜質(zhì)控制的研究及日常生產(chǎn)的質(zhì)量控制。