李晨雨，裴新國(guó)，張伊杰，高聰芬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，綠色農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，南京 210095）

從基因角度對(duì)害蟲進(jìn)行防控是一種新視角，其可以解決一些殺蟲劑所無法觸及的問題。CRISPR-Cas9作為第3代基因編輯技術(shù)，是當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但它仍處于高度實(shí)驗(yàn)的階段，使用價(jià)格高且還有許多未知的風(fēng)險(xiǎn)。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)作為一種存在于真核細(xì)胞中的基因調(diào)控機(jī)制，能引發(fā)特定基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，具有特異性、高效性、位置效應(yīng)、ATP依賴性和可傳播性等特點(diǎn)[1]，在病蟲害防治中展現(xiàn)出巨大的潛力，且因其不易與其他殺蟲劑產(chǎn)生交互抗性，因此成為一種新興的害蟲防控策略[2-3]。

關(guān)于RNAi最早的報(bào)道是1990年Napoli等[4]在牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)的共抑制現(xiàn)象。他通過注射植物花色的相關(guān)基因到牽?；ㄖ校乖觉r艷的花色變得白皙；比較基因的表達(dá)含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因花比正?；舛鹊土?0倍，原因在于導(dǎo)入的基因和內(nèi)源基因表達(dá)均被抑制，且該抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。Fire等[5]于1998年首先證實(shí)了RNAi現(xiàn)象，通過向秀麗隱桿線蟲中注射dsRNA后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)基因有極高的抑制作用，揭示了基因沉默的本質(zhì)，即dsRNA能有效地降低目標(biāo)基因的表達(dá)活性，并將這一現(xiàn)象命名為RNAi。目前，隨著RNAi技術(shù)的日趨成熟，越來越多的試驗(yàn)證實(shí)RNAi現(xiàn)象幾乎在所有真核生物中都有發(fā)現(xiàn)，包括原生動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、真菌、藻類和植物[6-7]。美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館（PubMed）上以“insect”和“RNAi”作為關(guān)鍵詞搜索發(fā)現(xiàn)，2000年以來昆蟲RNAi研究領(lǐng)域共有4580個(gè)相關(guān)的報(bào)道數(shù)據(jù)結(jié)果，近10年來所發(fā)表文章數(shù)約占數(shù)據(jù)結(jié)果的75%，總體呈逐年增多的趨勢(shì)，說明針對(duì)該研究領(lǐng)域進(jìn)行昆蟲的防控和相應(yīng)靶標(biāo)藥劑的研發(fā)正在快速發(fā)展，且越來越受到人們的重視。

筆者主要論述RNAi技術(shù)在昆蟲防控研究中的應(yīng)用和發(fā)展前景，從RNAi技術(shù)的原理、導(dǎo)入方法、效率及其在農(nóng)業(yè)害蟲中的應(yīng)用研究實(shí)例等4個(gè)方面進(jìn)行了綜述，旨在介紹其潛在的害蟲防治應(yīng)用前景。

1 RNAi的原理

RNAi存在于真核生物中，是一種強(qiáng)大的基因功能研究技術(shù)。RNAi的作用過程大致可分為3個(gè)階段，分別是起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段[8]。

起始階段：來自內(nèi)源或體外合成的dsRNA被轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)Dicer酶作用后，被剪切成21～25 bp的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）。

效應(yīng)階段：siRNA在宿主細(xì)胞中被細(xì)胞內(nèi)解旋酶解旋成兩條單鏈，其反義鏈（引導(dǎo)鏈）在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)信使RNA（mRNA），由核酸內(nèi)切酶將靶標(biāo)mRNA降解，使該mRNA表達(dá)量下降，從而促使靶標(biāo)基因沉默，細(xì)胞內(nèi)該基因功能喪失[9]。

擴(kuò)增階段：又稱信號(hào)級(jí)聯(lián)放大階段，即siRNA與靶序列mRNA結(jié)合后，以siRNA作為引物，RNA聚合酶催化合成新的dsRNA模板，之后重復(fù)前兩個(gè)階段，使RNA沉默作用不斷放大。

2 RNAi在昆蟲體內(nèi)的導(dǎo)入方法

如何將dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)在很大程度上影響著昆蟲RNAi的效果，同時(shí)在有害生物的防控應(yīng)用中也是極其關(guān)鍵的一環(huán)。目前，RNAi導(dǎo)入的主要方法有注射、浸泡、飼喂，以及在此基礎(chǔ)上衍生出來的轉(zhuǎn)基因植物介導(dǎo)、納米粒子包被、脂質(zhì)體修飾、病毒感染、共生體介導(dǎo)等。

注射法是目前研究昆蟲基因功能最常用的方法。該方法將dsRNA或siRNA在適當(dāng)?shù)娜芤褐型ㄟ^注射針插入昆蟲的胚胎或蟲體的特定部位，避開腸道直接到達(dá)血淋巴和相應(yīng)組織，可實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確到達(dá)作用部位，避開結(jié)構(gòu)障礙。由于注射條件的限制，該方法目前只能應(yīng)用于室內(nèi)昆蟲基因功能研究，無法大規(guī)模應(yīng)用于田間害蟲防治。

浸泡法，也稱為細(xì)胞外RNAi，一般是針對(duì)昆蟲細(xì)胞株，將昆蟲細(xì)胞直接浸泡在dsRNA的溶液里，誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。該方法在適宜的培養(yǎng)液濃度、溫度、時(shí)間等前提條件下，具有轉(zhuǎn)染速度快、周期短的優(yōu)點(diǎn)。

飼喂法是給昆蟲飼喂含有人工合成或微生物體內(nèi)合成dsRNA的食物，通過口器取食進(jìn)入蟲體的一種導(dǎo)入方法。與注射法相比，該方法沒有機(jī)械損傷，實(shí)際應(yīng)用更方便，已在鞘翅目昆蟲中取得較好效果，可用于高通量靶標(biāo)基因篩選和大田推廣[10]，但在鱗翅目昆蟲中效果差。昆蟲體內(nèi)的RNAi現(xiàn)象存在劑量限制，需要不斷地飼喂dsRNA才能使之產(chǎn)生持續(xù)RNAi現(xiàn)象，因此需要對(duì)劑量濃度和飼喂時(shí)間進(jìn)行把控。有研究[11]報(bào)道，針對(duì)亞洲柑橘木虱，通過將2種及2種以上針對(duì)不同靶標(biāo)基因的融合，dsRNA被飼喂進(jìn)入昆蟲體內(nèi)實(shí)現(xiàn)共沉默是一種很好的RNAi策略，可推廣應(yīng)用于害蟲防控。

轉(zhuǎn)基因植物法，即植物介導(dǎo)的昆蟲RNAi，是指將昆蟲靶標(biāo)基因的dsRNA表達(dá)在植物體中，昆蟲取食后生長(zhǎng)發(fā)育受阻，存活率和繁殖力下降，甚至影響子代生長(zhǎng)發(fā)育。目前，在小麥、水稻、玉米、棉花、煙草、馬鈴薯、擬南芥等植物中有所應(yīng)用，主要針對(duì)咀嚼式和刺吸式口器昆蟲，如鱗翅目幼蟲、鞘翅目和同翅目害蟲[7]。將昆蟲保幼激素RNAi抗蟲棉和RNAi＋Bt的聚合棉共同應(yīng)用可大大延緩棉鈴蟲對(duì)單一影響策略的抗性[12]。以上方法的關(guān)鍵是獲得含有昆蟲靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植物。

納米粒子包被和脂質(zhì)體修飾這2種新型導(dǎo)入方法，會(huì)更加有效地提高dsRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)中腸吸收，提高RNAi的效率，進(jìn)而促進(jìn)昆蟲RNAi研究和害蟲防治應(yīng)用。納米粒子作為分子載體，通過靜電作用與dsRNA結(jié)合，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的胞內(nèi)傳遞，保護(hù)dsRNA不受核酸酶和極端pH環(huán)境的影響。納米粒子具有低毒性，可以被細(xì)胞高效吸收。納米粒子系統(tǒng)進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后dsRNA的解離至關(guān)重要，它與dsRNA的聚合比例決定Dicer酶作用于dsRNA的能力，因此良好的配比是成功進(jìn)行RNAi的關(guān)鍵。目前，碳量子點(diǎn)、鳥苷酸聚合物、支鏈兩親性多肽膠囊（BAPC）等已成功用于促進(jìn)昆蟲dsRNA攝取的納米粒子系統(tǒng)[13-14]。脂質(zhì)體修飾是利用帶正電荷的脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的dsRNA通過靜電作用結(jié)合，協(xié)助dsRNA的經(jīng)口轉(zhuǎn)運(yùn)和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)中的傳遞，具有極好的生物相容性，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用該方法會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，抑制某些酶的活性[15]。

病毒感染法和共生體介導(dǎo)法均是通過以轉(zhuǎn)基因微生物為基礎(chǔ)生產(chǎn)dsRNA，再通過取食、體壁侵入或韌皮部共生等多種途徑導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)。病毒感染法，即病毒誘導(dǎo)的基因沉默，是將靶標(biāo)基因dsRNA通過病毒侵染途徑導(dǎo)入宿主體內(nèi)。此外，RNAi參與抵抗病毒的免疫反應(yīng)，有3種小分子RNA（小干擾RNA、微小RNA和Piwi蛋白）相互作用，例如，在蚊蟲體內(nèi)發(fā)揮抗蚊媒病毒的免疫作用[16]。研究抗病毒的RNAi途徑，抑制病毒在媒介昆蟲中的復(fù)制以及在益蟲（如蜜蜂和家蠶）中利用對(duì)非靶標(biāo)生物安全的病毒序列啟動(dòng)抗病毒RNAi反應(yīng)，對(duì)防止感染高致病性病毒和開發(fā)基于病毒基因的特異性殺蟲劑具有重要意義。物種特有的兼性腸道共生菌比常規(guī)微生物飼喂沉默效果好，具有宿主特異性。共生體介導(dǎo)法通過構(gòu)建缺乏RNase Ⅲ編碼基因來避免dsRNA在微生物體內(nèi)提前被降解，可以使腸道中dsRNA持續(xù)表達(dá)，能觀察到各個(gè)時(shí)期的表型變化。該方法成功的前提是昆蟲具有可培養(yǎng)的共生體。

3 農(nóng)業(yè)害蟲的RNAi應(yīng)用研究

結(jié)合上述dsRNA導(dǎo)入方法，對(duì)近幾年農(nóng)業(yè)害蟲（包括鞘翅目、半翅目、鱗翅目等常見的多種害蟲）的RNAi應(yīng)用研究實(shí)例進(jìn)行整理，結(jié)果見表1。其中大部分農(nóng)業(yè)害蟲在特定靶基因的沉默之后，產(chǎn)生死亡表型，具有RNAi田間廣泛應(yīng)用的潛力，為核酸農(nóng)藥生產(chǎn)提供參考。目前農(nóng)業(yè)害蟲的田間實(shí)際應(yīng)用防治主要是通過飼喂法以及在飼喂法基礎(chǔ)上建立起來的新型dsRNA導(dǎo)入方法，其中以玉米為主要應(yīng)用作物的轉(zhuǎn)基因植物法已經(jīng)得到美國(guó)、巴西和日本等8個(gè)國(guó)家和地區(qū)的安全性評(píng)價(jià)，并在2017年6月獲得了美國(guó)環(huán)境署的種植許可[17]，相信在未來發(fā)展中會(huì)得到更廣闊的應(yīng)用前景。

表1 農(nóng)業(yè)害蟲RNAi 應(yīng)用研究實(shí)例

4 RNAi效率的影響因素和脫靶效應(yīng)

4.1 影響因素

昆蟲RNAi技術(shù)的應(yīng)用在基因功能研究和害蟲防控上獲得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但沉默效率的多樣性正制約著該技術(shù)的進(jìn)一步提升。注射法可以將dsRNA高效地導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)引起沉默反應(yīng)，然而針對(duì)大多數(shù)鞘翅目和鱗翅目昆蟲，同樣采用飼喂法喂食dsRNA，前者沉默效率在100%左右，而后者卻對(duì)RNAi現(xiàn)象不敏感，效率甚至低于50%[41]。究其原因，影響RNAi效率的因素主要有以下幾方面：昆蟲腸道環(huán)境、靶標(biāo)基因的選擇、dsRNA的剪切形式和長(zhǎng)度。

4.1.1 昆蟲腸道環(huán)境

昆蟲腸道內(nèi)的消化核酸酶、過堿性pH條件、腸道微生物和圍食膜基質(zhì)是影響dsRNA穩(wěn)定的因素，同時(shí)也直接關(guān)乎RNAi的效率[10]。通過飼喂法導(dǎo)入dsRNA最大的問題就是腸道內(nèi)的核酸酶和腸道pH環(huán)境對(duì)dsRNA有強(qiáng)降解作用，破壞基因沉默的初始信號(hào)[42]。例如，在東亞飛蝗腸道中，dsRNase2對(duì)dsRNA的快速降解是導(dǎo)致口服dsRNA時(shí)RNAi效率低下的重要因素[43]。腸道微生物影響腸道的pH值，并分泌可降解dsRNA或干擾腸道細(xì)胞攝取的核酸酶。由幾丁質(zhì)和帶負(fù)電荷的糖蛋白組成的圍食膜基質(zhì)可能會(huì)阻止dsRNA有效地進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，且膜孔的大小影響dsRNA傳遞。

4.1.2 靶標(biāo)基因的選擇

RNAi技術(shù)成功應(yīng)用的重點(diǎn)是通過高通量篩選和基因功能驗(yàn)證確定害蟲高致死性的靶標(biāo)基因，從而進(jìn)一步判斷是否可作為害蟲防控的RNAi靶點(diǎn)。首先，昆蟲在細(xì)胞和組織水平上是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取dsRNA，所以與細(xì)胞膜運(yùn)輸相關(guān)的基因靶點(diǎn)似乎是一些最致命的昆蟲RNAi靶點(diǎn)[44]。其次，在幼蟲和成蟲發(fā)育時(shí)期的關(guān)鍵基因可以作為致死基因。卵期和蛹期昆蟲處于表面靜止?fàn)顟B(tài)，無法取食dsRNA，之后昆蟲將進(jìn)入活動(dòng)性強(qiáng)的幼蟲期或成蟲期，發(fā)生取食危害，篩選卵期和蛹期關(guān)鍵致死基因?qū)τ诤οx防治至關(guān)重要，如沉默與褐飛虱蛻皮相關(guān)的NlRan基因后，褐飛虱因蛻皮困難致死，雌蟲繁殖能力受到影響[45]。

4.1.3 dsRNA的剪切形式及長(zhǎng)度

Dicer酶對(duì)dsRNA進(jìn)行剪切是整個(gè)RNAi過程的關(guān)鍵步驟，不同物種昆蟲dsRNA的剪切形式是RNAi效率不同的原因之一[46]。有研究[47]發(fā)現(xiàn)，dsRNA的剪切偏好性位點(diǎn)在鞘翅目中呈現(xiàn)多樣性，而在鱗翅目昆蟲中Dicer酶的剪切偏好位點(diǎn)是GGU，這可能是導(dǎo)致在兩種目中RNAi效率存在較大差異的原因，也可能是導(dǎo)致物種間RNAi效率不同的原因。此外，dsRNA的長(zhǎng)度也影響RNAi效率。赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)只有大于31 bp的小分子RNA才能誘導(dǎo)RNAi產(chǎn)生[48]；植物介導(dǎo)昆蟲RNAi防治害蟲的靶標(biāo)基因dsRNA長(zhǎng)度應(yīng)大于60 bp，且在一定范圍內(nèi)長(zhǎng)度越長(zhǎng)，RNAi效率越高[49]。

4.2 脫靶效應(yīng)

基因沉默的準(zhǔn)確性是由siRNA參與介導(dǎo)的，siRNA引導(dǎo)的基因沉默不僅可以和靶標(biāo)基因結(jié)合，由于導(dǎo)入片段的特異性不強(qiáng)，也可以和非靶標(biāo)基因結(jié)合導(dǎo)致基因沉默，這種現(xiàn)象稱為脫靶效應(yīng)[50]。目前基因編輯技術(shù)的應(yīng)用都會(huì)存在脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，使得靶標(biāo)基因表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化。導(dǎo)致脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的因素有很多，當(dāng)dsRNA與mRNA的匹配長(zhǎng)度超過相應(yīng)堿基對(duì)后就會(huì)產(chǎn)生較高的脫靶效應(yīng)。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，前者匹配長(zhǎng)度超過19 bp后會(huì)產(chǎn)生較高的假陽性結(jié)果，而后者則在超過40 bp且相似性高于95%時(shí)會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)[45]。如果將設(shè)計(jì)的dsRNA針對(duì)的mRNA序列與其他基因比對(duì)分析后沒有發(fā)現(xiàn)連續(xù)19 bp的堿基完全相同，則基本就可以保證特異的對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行沉默。此外，RNAi脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生與siRNA/dsRNA的濃度有關(guān)。設(shè)計(jì)適宜濃度的混合siRNA/dsRNA進(jìn)行干擾比單一轉(zhuǎn)染的siRNA或者dsRNA更能降低脫靶效應(yīng)[10]?，F(xiàn)有研究[44]表明，如果針對(duì)同一基因的不同區(qū)域設(shè)計(jì)多種dsRNA，則可以有效避免脫靶效應(yīng)。

田間脫靶效應(yīng)的出現(xiàn)會(huì)使靶標(biāo)生物的非靶標(biāo)基因沉默，也可能會(huì)導(dǎo)致其他非靶標(biāo)生物甚至有益生物基因沉默，從而產(chǎn)生一系列潛在的安全性問題，如Bachman等[51]報(bào)道了玉米根螢葉甲的Snf7基因dsRNA對(duì)不同昆蟲的脫靶效應(yīng)。然而，正確地運(yùn)用脫靶效應(yīng)的原理，通過比較不同生物基因組序列，選擇有害生物物種間保守而有益生物同源性低的序列作為靶標(biāo)基因，可在昆蟲防控研究應(yīng)用上將植物介導(dǎo)的昆蟲RNAi和核酸農(nóng)藥設(shè)計(jì)得更廣譜和安全。

5 結(jié)語與展望

RNAi技術(shù)作為21世紀(jì)的變革性技術(shù)，不但在研究昆蟲不同發(fā)育階段的基因功能上發(fā)揮了重要作用，而且RNAi技術(shù)也為害蟲防治提供了極具潛力的特異性殺蟲劑研發(fā)新思路。目前，孟山都公司預(yù)計(jì)2020年上市基于RNAi開發(fā)的防控農(nóng)業(yè)害蟲和病毒的核酸農(nóng)藥產(chǎn)品[52]。雖然該項(xiàng)技術(shù)直接用于害蟲防治還存在制造成本高、易受環(huán)境影響等因素限制，但相信隨著昆蟲分子生物學(xué)研究的不斷深入，RNAi技術(shù)在昆蟲防控研究中的應(yīng)用也會(huì)更加廣泛。合成dsRNA效率的提高、核酸生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用成本的降低，終將會(huì)促使其從實(shí)驗(yàn)室走向田間，推動(dòng)植物保護(hù)技術(shù)取得更大發(fā)展。