張振偉 周偉堅 馬紫英 倪 焱 楊水蓮 莫美華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642））

巨大口蘑（Macrocybe gigantea）屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘 菌 綱（Agaricomycetes）、傘 菌 目（Agaricales）、白蘑科（口蘑科）（Tricholomataceae）、大杯傘屬（Macrocybe）的一種珍稀食藥用菌，異名洛巴伊口蘑（Tricholoma lobayense）、大白口蘑（Tricholoma spectabilis）[1]。巨大口蘑屬高溫食用菌，自然界主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國的廣西、廣東、福建、湖南、臺灣等?。▍^(qū)）均有分布[2]。巨大口蘑子實體碩大，外形優(yōu)美，不易開傘，菌肉致密，口感鮮嫩爽脆，并且含有豐富的粗多糖、粗纖維、粗蛋白和礦質(zhì)元素，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗高血壓及提高免疫力等多種功效[3-8]。2009 年9月莫美華等在廣東省廣州市東莞莊路采集到一株野生巨大口蘑菌株并將其命名為新1（菌株號dongguanzhuang），其 ITS 序列已提交 NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心）。試驗對該菌株菌絲培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，以期為該菌株馴化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

巨大口蘑菌株dongguanzhuang（以下稱新1菌株，ITS 序列NCBI 編號：JX068527），由野外采集（圖1），采用組織分離法分離純化得到其菌絲體。

1.2 試驗培養(yǎng)基[9-10]

培養(yǎng)基1：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.15%，MgSO40.05%，瓊脂2%。

培養(yǎng)基2：葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.15%，MgSO40.05%，瓊脂2%。

培養(yǎng)基3：葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，瓊脂2%。

培養(yǎng)基4：葡萄糖2%，硝酸鈉0.2%，瓊脂2%。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)溫度試驗[11-12]

試驗采用培養(yǎng)基1，pH 自然。培養(yǎng)溫度分別為24.0 ℃、26.0 ℃、28.0 ℃、30.0 ℃、32.0 ℃、34.0 ℃。觀察不同培養(yǎng)溫度對新1 菌株菌絲生長（以下稱菌絲生長）的影響。每個處理設(shè)5個重復(fù)。

1.3.2 pH試驗[13]

試驗采用培養(yǎng)基2。培養(yǎng)基pH 分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀測不同pH 對菌絲生長的影響。每個處理設(shè)5 個重復(fù)。

1.3.3 碳源試驗[11]

分別以可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖作為培養(yǎng)基2中的碳源，并設(shè)不外加碳源的培養(yǎng)基為對照組。接種后置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長情況。每個處理設(shè)5個重復(fù)。

1.3.4 氮源試驗[11-12，14]

分別以硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、牛肉膏作為培養(yǎng)基2 氮源，并設(shè)不含外加氮源的培養(yǎng)基為對照組。接種后置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察不同氮源培養(yǎng)基上菌絲生長情況。每個處理設(shè)置5個重復(fù)。

1.3.5 無機(jī)鹽試驗[12，15]

在培養(yǎng)基3 中分別添加供試無機(jī)鹽ZnSO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、KCl、FeSO4。加入KH2PO4的質(zhì)量濃度（g/L）為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0；加入MgSO4、KCl、CaCl2的質(zhì)量濃度（g/L）為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5；加入ZnSO4、FeSO4的質(zhì)量濃度（g/L）為 0.02、0.06、0.10、0.14、0.18。對照組不添加無機(jī)鹽。接種后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察不同濃度無機(jī)鹽對菌絲生長的影響。每個處理設(shè)置5個重復(fù)。

1.3.6 維生素試驗

在培養(yǎng)基4 中分別加入質(zhì)量濃度（mg/L）為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的葉酸、煙酸、VB6、VB1、VB2、泛酸、VC（采用過濾除菌法在添加維生素的過程中除菌，濾菌器孔徑為0.22 μm），對照組不添加維生素。接種后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察不同質(zhì)量濃度維生素對菌絲生長的影響。每個處理設(shè)置5個重復(fù)。

1.3.7 接種及測定方法[16]

無菌環(huán)境中，用圓形打孔器打取菌塊接種至試驗平板培養(yǎng)基中心，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔72 h 測量一次菌落直徑并記錄菌絲的生長勢，計算菌絲的平均生長速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對新1菌株菌絲生長的影響

由表1可知，培養(yǎng)溫度為26～34 ℃，新1菌株菌絲均可生長（以下稱菌絲生長），培養(yǎng)溫度為30 ℃時菌絲平均長速最快，但與培養(yǎng)溫度為28 ℃、32 ℃無顯著差異。培養(yǎng)溫度為24 ℃時，菌絲生長緩慢，且長勢稀。

表1 試驗培養(yǎng)溫度對新1菌株菌絲生長的影響

2.2 pH對新1菌株菌絲生長的影響

由表2 可知，在pH 5～8 培養(yǎng)基上菌絲平均生長速度差異不顯著，但pH 6、pH 7 培養(yǎng)基上菌絲長勢最為濃密。

2.3 供試碳源對新1菌株菌絲生長的影響

由表3可知，在所有供試碳源培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基上菌絲均可生長，在碳源為果糖的培養(yǎng)基上菌絲平均長速最快，長勢濃密。在碳源為蔗糖的培養(yǎng)基上菌絲平均長速其次，與果糖為碳源的培養(yǎng)基相比有顯著的差異。在碳源為乳糖的培養(yǎng)基上菌絲平均長速最慢，長勢較濃密。

2.4 供試氮源對新1菌株菌絲生長的影響

由表4 可知，在不同氮源的培養(yǎng)基上新1 菌株菌絲生長存在較大的差異。新1菌株菌絲在以牛肉膏或酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上平均長速最快，并且兩者沒有顯著的差異，菌絲長勢也濃密。在氮源為蛋白胨的培養(yǎng)基上新1 菌株菌絲平均長速其次，長勢較濃密。在氮源為NaNO3或（NH4）2SO4的培養(yǎng)基上新1 菌株菌絲平均長速較慢，長勢稀。在氮源為尿素的培養(yǎng)基上新1菌株菌絲不能生長。

表4 不同氮源對新1菌絲生長的影響

2.5 供試無機(jī)鹽對新1菌株菌絲生長的影響

由圖2 可知，隨著培養(yǎng)基中添加KH2PO4質(zhì)量濃度的上升，新1菌株菌絲生長受到顯著的抑制。

圖2 KH2PO4對新1菌株菌絲生長的影響

由圖3 可知，添加質(zhì)量濃度為0.5 g/L 的MgSO4對新1 菌株菌絲生長有顯著的抑制作用；加入質(zhì)量濃度為0.5 g/L 的KCl也對新1菌株菌絲生長有顯著影響；質(zhì)量濃度為1.0 g/L或高于該濃度的CaCl2對新1菌株菌絲生長有顯著的抑制作用。

由圖4 可知，添加質(zhì)量濃度為0.1 g/L 或高于該濃度的ZnSO4，添加質(zhì)量濃度為0.06 g/L 或高于該濃度的FeSO4均對新1 菌株菌絲的生長有顯著的抑制作用。

圖3 無機(jī)鹽（MgSO4、KCl、CaCl2）對新1菌株菌絲生長的影響

圖4 無機(jī)鹽（ZnSO4、FeSO4）對新1菌株菌絲生長的影響

2.6 維生素對新1菌株菌絲生長的影響

由圖5、圖6、圖7 可知，培養(yǎng)基加入一定質(zhì)量濃度的維生素 B1（VB1）、煙酸、泛酸、葉酸、維生素 C（VC）對新1 菌株菌絲生長無顯著影響；加入質(zhì)量濃度為2 mg/L 或高于該濃度的維生素B6（VB6）對新1菌株菌絲生長有顯著促進(jìn)作用。

圖5 維生素（VB1、VB2、VB6）對新1菌株菌絲生長的影響

圖6 維生素（煙酸、泛酸）對新1菌株菌絲生長的影響

圖7 維生素（葉酸、VC）對新1菌株菌絲生長的影響

3 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明，新1 菌株菌絲生長適宜的溫度為28～32 ℃，最適溫度為 30 ℃；培養(yǎng)基適宜 pH5～8，最適pH 為6，最適碳源為果糖，最適氮源為牛肉膏、酵母膏，在此條件下新1 菌株菌絲生長速度快且長勢旺盛、濃密。較高濃度的無機(jī)鹽對菌絲生長均有顯著的抑制作用，維生素B2、維生素B6對菌絲生長有顯著促進(jìn)作用，維生素B1、煙酸、泛酸、葉酸、維生素C對菌絲生長沒有顯著性影響。

試驗培養(yǎng)基加入0.18 g/L FeSO4時，新1 菌株仍然能生長，但菌絲稀。分析出現(xiàn)異常的可能原因：一是接種時雖然選取了在相同條件下培養(yǎng)的同一批次菌種，但是由于菌絲發(fā)育的個體差異，不排除不同平板培養(yǎng)基上的菌種對無機(jī)鹽的耐受性存在細(xì)微的差別，導(dǎo)致菌絲在高濃度無機(jī)鹽平板上有少量生長；二是培養(yǎng)箱的不同空間位置可能造成培養(yǎng)溫度等條件存在細(xì)微差異；總體來講，高濃度無機(jī)鹽抑制新1菌株菌絲生長，個別處理出現(xiàn)輕微異?？赡苄枰M(jìn)一步規(guī)范試驗操作、減少系統(tǒng)誤差來消除。

巨大口蘑作為一種品質(zhì)優(yōu)良的食用菌，具有較高的推廣栽培價值，但目前對其生物學(xué)特性和栽培條件的研究還較少。研究結(jié)果對野生巨大口蘑新1菌株推廣具有一定參考價值。