張藍(lán)天，方云霞，張子玲，李 佳，牛春玉，張 弦，吳玉環(huán)，張曉勤，薛大偉

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

鋁(Aluminium, Al)是酸性土壤中對植物產(chǎn)生毒害的主要因子，在土壤中的含量僅次于氧和硅.通常情況下，大部分鋁以固態(tài)硅酸鹽形式存在于土壤中，對植物和環(huán)境無毒害作用[1].當(dāng)土壤的pH低于5.0時，鋁溶解度會大大增加，轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子態(tài)，導(dǎo)致土壤中高活性鋁的含量迅速增加，從而對植物產(chǎn)生毒害.大麥(HordeumvulgareL.)是集經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物和飼料作物于一體的農(nóng)作物，在眾多禾本科農(nóng)作物中，受鋁毒害尤為嚴(yán)重，這極大地限制了大麥在酸性土壤中的種植.鋁對植物的毒害主要表現(xiàn)為導(dǎo)致根、莖生長遲緩，新葉變小，葉片失綠、卷曲，莖變短，葉柄萎縮；從生理生化方面來看，表現(xiàn)為抑制酶的活性和DNA復(fù)制，破壞細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，擾亂激素平衡，引起氧化脅迫和膜的損傷等，最終導(dǎo)致生物量和產(chǎn)量的下降.

硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)是外源一氧化氮(nitric oxide, NO)供體.NO是植物體內(nèi)一種重要的氧化還原信號分子，屬于活性氮范疇.NO參與植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、光化學(xué)反應(yīng)、衰老等一系列生理過程[2-3].除此之外，Wang等研究發(fā)現(xiàn)NO能顯著緩解鋁對決明子的毒害，NO預(yù)處理能顯著緩解鋁對植株生長的抑制，減少鋁脅迫引起的膜脂過氧化和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累[4].Ruan等研究發(fā)現(xiàn)，合適濃度的SNP處理能顯著增強(qiáng)小麥幼苗超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性，緩解由NaCl處理引起的小麥葉片氧化損傷[5].

通過觀測根長、SOD和POD活性變化、H2O2和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量變化等，初步探討NO對鋁脅迫下大麥根部受損的緩解作用.其次，利用SRAP (sequence-related amplified polymorphism)分子標(biāo)記分析大麥根部DNA的損傷情況.通過對SRAP圖譜與生理生化指標(biāo)的綜合分析，探索外源SNP緩解大麥根部鋁毒害的生理及分子機(jī)制，為解決酸性土壤中的鋁毒問題，提高大麥產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

大麥處理：對Z17和GP兩個大麥品種進(jìn)行萌發(fā)處理，培養(yǎng)至生長出2～3片幼葉后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

鋁處理：分別用0、10、20、50、100 μmol·L-1的AlCl3(含1 mmol·L-1CaCl2，pH=5.5)對大麥進(jìn)行24 h鋁處理，測量并計算相對根長.根據(jù)鋁處理后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取適宜的鋁濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

SNP處理：通過鋁處理獲取適宜的鋁濃度(10 μmol·L-1)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn).設(shè)置處理組：(1) Control：全營養(yǎng)液培養(yǎng)；(2) Al+0：10 μmol·L-1；(3) Al+50：10 μmol·L-1+50 μmol·L-1SNP；(4) Al+100：10 μmol·L-1+100 μmol·L-1SNP；(5) Al+200：10 μmol·L-1+200 μmol·L-1SNP；(6) Al+300：10 μmol·L-1+300 μmol·L-1SNP.大麥全營養(yǎng)液成分參考Zhang等[1]提供的方法.

1.2 相對根長的計算

用刻度尺分別測量對照組和各處理組大麥幼苗的根長，求得平均值并計算相對根長.

相對根長(relative root length, REL)=[(待測組根伸長量-Control組根伸長量)/Control組根伸長量]×100%.

1.3 抗氧化酶活性及MDA、H2O2含量測定

SOD活性測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride, NBT)光化還原法[6].POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法[7].過氧化氫(H2O2)含量測定采用紫外分光光度技術(shù)[8].MDA含量通過硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)顯色法測定[9].SOD活性、H2O2含量以及MDA含量測定均重復(fù)3次.

1.4 DNA提取和SRAP分析

鋁處理后大麥幼苗根部DNA提取和SRAP篩選采用Mengoni等的方法[10].通過獨(dú)立實(shí)驗(yàn)從17對引物中篩選出7對(表1)多態(tài)性較好的SRAP引物，交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成.通過凝膠電泳后DNA條帶的消失和出現(xiàn)顯示多態(tài)性變化.

表1 本研究所用的引物序列Tab.1 The sequence of SRAP primers

1.5 基因組模板穩(wěn)定性估計

SRAP圖譜的變化可以用基因組模板穩(wěn)定性(genome template stability, GTS)表示，計算公式為

GTS =(1-a/n)×100%，

其中：a為處理組幼苗SRAP多態(tài)性譜帶數(shù)，即與對照組相比，處理組新出現(xiàn)的和消失的PCR譜帶之和；n為對照組總譜帶數(shù)[11-12].

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥對鋁脅迫的反應(yīng)

在含0、10、20、50、100 μmol·L-1AlCl3的全營養(yǎng)液中處理兩葉期的大麥幼苗，并在24 h、48 h和72 h后分別測量大麥幼苗根長，并計算相對根長.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20、50、100 μmol·L-1AlCl3處理下的大麥幼苗相繼停止生長，10 μmol·L-1AlCl3培養(yǎng)下的大麥幼苗根部可以生長，但根部出現(xiàn)發(fā)黃變黑現(xiàn)象，生長緩慢.為保證后續(xù)研究中大麥幼苗根部能正常生長，故選擇10 μmol·L-1AlCl3用于后續(xù)鋁脅迫處理.

2.2 外源SNP對鋁脅迫下大麥幼苗根長的影響

鋁脅迫下Z17和GP兩個品種大麥幼苗的根長基本短于Control組大麥幼苗的根長(圖1-A)，呈現(xiàn)出極顯著差異，這證明鋁脅迫會抑制大麥幼苗根的生長.然而，添加SNP能在一定程度上緩解鋁對大麥幼苗根部的毒害.其中，當(dāng)SNP濃度低于100 μmol·L-1時，其緩解作用隨濃度的增加而提高；當(dāng)SNP濃度高于100 μmol·L-1時，其緩解作用有所降低.當(dāng)SNP濃度等于100 μmol·L-1時，Z17品種大麥幼苗的根長與Control已無顯著差異，GP品種大麥幼苗根的生長卻受到抑制.以上結(jié)果說明，合適濃度的SNP具有緩解鋁毒害的作用，且這種作用具有品種特異性.

A：相對根長；B：SOD活性；C：POD活性；D：H2O2含量；E：MDA含量.差異顯著性分析方法：單因素方差分析(*P<0.05, **P<0.01)；誤差棒：標(biāo)準(zhǔn)誤差.圖1 外源SNP對Al脅迫下Z17和GP幼苗不同生理指標(biāo)的影響(n=5)Fig.1 Effects of exogenous SNP on different physiological indexes of Z17 and GP seedlings under Al stress(n=5)

2.3 外源SNP對鋁脅迫下SOD和POD活性的影響

正常條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡中，但在逆境脅迫下，植物體內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生的速度超出清除速度，導(dǎo)致活性氧的積累而使植物遭受傷害[13].SOD能將超氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2，再由POD將H2O2分解成H2O.與Control相比，單獨(dú)鋁處理的大麥幼苗根部POD和SOD活性顯著升高(圖1-B和圖1-C)；而加入不同濃度的SNP后，活性有不同程度的降低，同樣具有品種特異性.在SNP的作用下大麥幼苗根部的SOD活性下降，在GP品種中SOD活性下降與SNP的濃度無明顯相關(guān)性，但Z17品種中SNP濃度大于50 μmol·L-1時與未加SNP時相比下降顯著.總體上看，50 μmol·L-1SNP (Al+50)和100 μmol·L-1SNP (Al+100)對降低鋁脅迫后的SOD和POD活性有明顯作用.

2.4 外源SNP對鋁脅迫下MDA和H2O2含量的影響

在逆境條件下植物細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生膜脂過氧化.MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一，對細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性，會破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能[13]，因此可通過MDA的含量衡量細(xì)胞脂膜過氧化程度.結(jié)果表明，鋁脅迫下幼苗根系中的MDA和H2O2含量明顯高于正常水平(圖1-D和圖1-E).除100 μmol·L-1SNP培養(yǎng)的大麥幼苗外，其余大多數(shù)幼苗根部H2O2含量與Control相比均有極顯著增加.此外，0、50 μmol·L-1SNP培養(yǎng)的大麥幼苗根部MDA含量極顯著增加.綜上，0、50 μmol·L-1SNP處理會導(dǎo)致膜脂過氧化，從而顯著提高大麥幼苗根部MDA含量和H2O2含量.

2.5 外源SNP對鋁脅迫下基因組多態(tài)性的影響

鋁會引起大麥根部SRAP譜帶中條帶數(shù)目增加、減少、變亮或變暗，而外源SNP可以改變條帶的變化，使條帶與Control組相似.不同濃度SNP處理的大麥幼苗根系中SRAP條帶均有所改變，部分處理組條帶變化較為明顯(圖2).GTS是檢測DNA多態(tài)性變化的重要指標(biāo)，結(jié)果顯示GTS為31.5%～66.7%，SRAP多態(tài)性變化如表2所示.

A：引物em1-me9；B：引物em8-me6.標(biāo)準(zhǔn)分子量為100 bp plus.

表2 外源SNP對鋁脅迫下Z17和GP幼苗根部DNA穩(wěn)定性(GTS, %)的影響Tab.2 Effects of exogenous NO on DNA stability (GTS, %) of Z17 and GP seedling roots under Al stress

在引物em1-me9和em8-me6中，鋁處理導(dǎo)致GP對應(yīng)的條帶減少了2條(圖2-A)，而加入SNP后條帶恢復(fù)為Control組對應(yīng)的水平(圖2-B).Z17經(jīng)鋁處理后不僅條帶減少了1條，條帶的亮度也下降；在SNP處理后條帶數(shù)目增加、亮度增加.以上結(jié)果說明，GTS與SNP有一定的相關(guān)性.在一定范圍內(nèi)(0～100 μmol·L-1)，添加的SNP濃度越高，對鋁毒害幼苗的緩解作用越好.當(dāng)SNP濃度超過100 μmol·L-1后，SNP對鋁毒害的緩解能力隨濃度的增加逐漸降低.在Z17幼苗中，Al+50 μmol·L-1處理組大麥幼苗根部基因組模板穩(wěn)定性最高，GTS為53%；在GP幼苗中，Al+100 μmol·L-1處理組大麥幼苗根部基因組模板穩(wěn)定性最高，GTS為67%(表2).

3 討論

土壤酸化會導(dǎo)致土壤中鋁離子濃度增加.鋁離子脅迫能夠通過增加活性氧的產(chǎn)生使植物細(xì)胞分子受到損傷，對植物產(chǎn)生毒害作用，影響植物生長.NO是一種可擴(kuò)散的、具有氧化還原活性的小生物活性的氣體信號分子，它可以參與植物非生物脅迫抗性機(jī)制.Singh等報道外源NO可以抑制水稻根系活性氧清除系統(tǒng)的活性，部分阻止砷脅迫下抗氧化活性的增加[14].截至目前，眾多研究結(jié)果表明外源NO還能夠緩解金屬Cd、A1、Cu引起的氧化傷害，調(diào)控抗氧化酶活水平，為植物系統(tǒng)提供更好的活性氧清除能力.

本研究選取了Z17和GP品種的大麥，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定以10 μmol·L-1作為鋁離子的脅迫濃度，在此濃度下加入0、50、100、200、300 μmol·L-1SNP，對大麥幼苗進(jìn)行抗氧化酶活性、MDA含量、H2O2含量測定及SRAP圖譜分析，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，得出能緩解鋁毒害大麥幼苗的SNP濃度.以上研究成果有利于解決酸性土壤中鋁脅迫的問題，增加大麥等經(jīng)濟(jì)作物的種植面積.

研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫可使大麥根的伸長受到抑制，這與Horst等[15]得出鋁毒導(dǎo)致根伸長受到抑制的結(jié)論相同.鋁脅迫還會使幼苗POD和SOD活性提高，H2O2和MDA含量增加，引發(fā)DNA損傷或損傷DNA修復(fù)系統(tǒng).外源SNP處理可降低SOD、POD的活性，減少H2O2和MDA含量，減少鋁脅迫對大麥幼苗修復(fù)系統(tǒng)的影響，降低鋁脅迫對大麥幼苗DNA的損傷率，對鋁毒害大麥具有緩解作用，保護(hù)大麥免受鋁脅迫的傷害.在一定范圍內(nèi)，外源SNP濃度與緩解作用有著較好的相關(guān)性.目前研究成果表明，外源NO可明顯改善鋁對決明子[4]、水稻[16]、黑麥和小麥[17]根伸長的抑制，改變抗氧化酶活性，減少對細(xì)胞膜的損害，這也表明NO能夠參與植物耐鋁毒的調(diào)控過程.研究中，50、100 μmol·L-1SNP對鋁毒害大麥幼苗緩解作用效果較明顯，其中100 μmol·L-1SNP效果更為顯著.然而，200、300 μmol·L-1SNP對鋁毒害幼苗的緩解作用下降.這與外源NO的雙重生理效應(yīng)有關(guān)，即低濃度NO在防御反應(yīng)中起保護(hù)作用，高濃度NO會對植物體產(chǎn)生嚴(yán)重傷害[18].Atienzar等研究表明，環(huán)境污染物會誘導(dǎo)生物體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生DNA損傷和突變，導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸缺失或增加，最終影響基因圖譜變化[11].在鋁脅迫下，SRAP引物擴(kuò)增得到的大麥幼苗根SRAP圖譜表現(xiàn)為SRAP條帶的增多、減少、變亮和變暗.SRAP條帶在0、50、100、200、300 μmol·L-1SNP處理的幼苗根系中均有所改變，部分條帶變化較為明顯.以上結(jié)果說明大麥基因穩(wěn)定性發(fā)生較大變化，基因組模板發(fā)生改變.與生理測定結(jié)果相符的是，50 μmol·L-1和100 μmol·L-1的SNP SRAP圖譜與Control相似，GTS較高，即基因組模板穩(wěn)定性較好，且部分條帶亮度增加.這說明SNP對鋁毒害大麥DNA損傷或修復(fù)系統(tǒng)有較好的緩解作用.

近年來研究發(fā)現(xiàn)，外源NO除緩解決明子[4]、紅蕓豆[19]和小麥[20]等植物受到的鋁脅迫外，也可緩解鎘脅迫[2]、氯化鈉脅迫[21]、干旱脅迫[22]等對植株的毒害作用.本研究通過探究不同濃度的外源SNP對鋁毒害大麥的緩解作用確定適宜濃度，為有效應(yīng)對酸性土壤面積擴(kuò)大對作物種植產(chǎn)生的不良影響，改善作物的生長環(huán)境和產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ).