劉平原 沈思琪 武燕翔 陳連鳳 嚴(yán)曉偉

100730 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)以內(nèi)皮下脂質(zhì)蓄積、粥樣斑塊形成及動(dòng)脈管腔狹窄為特征，可引起冠心病、腦梗死、外周血管病等一系列疾病，是世界范圍內(nèi)最常見的疾病和死亡原因[1]。ABCG1是跨膜半轉(zhuǎn)運(yùn)體，在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)并介導(dǎo)膽固醇外流，對體內(nèi)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)有重要作用。本課題組前期臨床研究提示人類巨噬細(xì)胞ABCG1的表達(dá)可能具有促AS作用[2]，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。近來研究發(fā)現(xiàn)氧化固醇，如7β-羥基膽固醇(7β-hydroxycholesterol，7β-OHC)和7-酮基膽固醇(7-ketochlesterol，7-KC)等[3]，與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建ABCG1敲低單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株，測定其氧化固醇外流情況，以探究ABCG1影響AS發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫)，RPMI1640培養(yǎng)基、FBS(GIBCO公司)，引物(上海生物工程公司)，慢病毒表達(dá)載體、DH5α、轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000、NBD-膽固醇(Invitrogen公司)，DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司)，兔抗人ABCG1抗體(Abcam公司)，兔抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)IgG(中杉金橋生物公司)，PMA、HDL(Sigma公司)，ox-LDL(北京協(xié)生生物公司)，質(zhì)粒測序由Invitrogen公司完成。

1.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

根據(jù)ABCG1基因序列設(shè)計(jì)shRNA oligo，將其連接到pGMLV-SC5RNAi載體構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒，選取測序正確的質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝；按照MOI=80利用慢病毒感染THP-1細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法篩選出穩(wěn)定敲低細(xì)胞株；提取穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行Western blot鑒定ABCG1表達(dá)。ABCG1 shRNA上游序列5’-gatccGGACCTGCTGAATGGACATCTT TCAAGAGAAGATGTCCATTCAGCAGGTCCTTTTTTg-3’，下游序列5’-aattcAAAAAAGGACCTGCTGAA TGGACATCTTCTCTTGAAAGATGTCCATTCAGCAGG TCCg-3’。陰性對照上游序列5’-gatccGTTCT CCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTT CGGAG-3’，下游序列5’-aattcACGCGTAAAAAA GTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGAC ACGTTCGGAGAACg-3’。

1.3 巨噬細(xì)胞氧化固醇外流測定

1.3.1 細(xì)胞處理及樣本收集 THP-1細(xì)胞以3×105/孔的密度接種于24孔板，以100 ng/ml PMA促進(jìn)巨噬化。72 h后更換培養(yǎng)基，以無血清培養(yǎng)基饑餓8 h，以50 μg/ml 氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)干預(yù)。24 h后，PBS洗滌細(xì)胞三次，加入50 μg/ml 高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)作為外流接受體誘導(dǎo)外流4 h，并設(shè)置空白對照組。收集外流液，12 000 rpm離心10 min，去除細(xì)胞碎片。PBS洗滌細(xì)胞三次，每孔加入10%甲醇水溶液+1%乙酸處理細(xì)胞5 min，收集裂解液。向外流液與細(xì)胞裂解液中加入3倍體積沉淀劑沉淀蛋白，10 000 rpm離心10 min，取5 μl進(jìn)行脂質(zhì)分析。

1.3.2 樣本分析 通過LC-MS/MS(DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀 Thermo Q EXACTIVE)進(jìn)行樣本分析。將收集到的樣本經(jīng)ACQUITY BEH C18色譜柱分離 (1.7 μm，2.1×50 mm)。隨后進(jìn)行一個(gè)從70%水-30%乙腈到100%乙腈的8 min梯度洗脫，設(shè)定流速為0.25 ml/min。采用電噴霧正離子源，以二級數(shù)據(jù)依賴性掃描的檢測模式，對樣本進(jìn)行定性與定量分析。7β-OHC和7-KC標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用于樣本定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ABCG1基因小干擾RNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)株ABCG1蛋白表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)可觀察到明顯的熒光，表明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常，目的質(zhì)粒熒光標(biāo)記基因表達(dá)正常(圖1)；ABCG1敲低組(ABCG1-sh)ABCG1蛋白表達(dá)水平(0.173 5±0.034 35，n=3)明顯低于陰性對照組(0.755 6±0.044 54，n=3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖2，提示ABCG1穩(wěn)定敲低細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光觀察

圖2 各組細(xì)胞ABCG1蛋白水平

2.2 ABCG1低表達(dá)對氧化固醇外流率的影響

通過LC-MS/MS技術(shù)對待測樣品進(jìn)行了氧化固醇定性與定量分析，發(fā)現(xiàn)與無外流接受體的空白對照組相比，HDL作為外流接受體的組別，誘導(dǎo)氧化型膽固醇外流率增加(7-KC：28.6%±2.3%比4.1%±0.7%，P<0.001；7β-OHC：35.5%±5.7%比3.7%±1.1%，P<0.001)，見圖3A。與陰性對照組相比，ABCG1敲低組氧化型膽固醇的外流率降低(7-KC：16.1%±3.1%比24.7%±2.3%，P<0.05；7β-OHC：15.7%±0.7%比33.1%±3.7%，P<0.001)，見圖3B。

圖3 巨噬細(xì)胞氧化固醇外流率

2.3 ABCG1低表達(dá)對巨噬細(xì)胞胞內(nèi)氧化固醇沉積的影響

胞內(nèi)氧化固醇沉積量通過細(xì)胞總蛋白進(jìn)行校正，結(jié)果顯示，與對照組比較，ABCG1低表達(dá)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)氧化固醇沉積增加[7-KC：(6.61±1.28)μg/mg比(2.13±0.08)μg/mg，P<0.05；7β-OHC：(1.61±0.51)μg/mg比(0.65±0.20)μg/mg，P<0.05]，見圖4。結(jié)合圖3結(jié)果表明巨噬細(xì)胞ABCG1低表達(dá)可抑制氧化固醇7β-OHC及7-KC外流，增加胞內(nèi)氧化固醇沉積。

圖4 巨噬細(xì)胞胞內(nèi)氧化固醇沉積

3 討論

巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞是AS的早期病理標(biāo)志[1]。構(gòu)建ABCG1敲低巨噬細(xì)胞模型可為ABCG1及AS的研究創(chuàng)造條件。本課題組前期通過嘌呤霉素篩選法構(gòu)建了ABCG1敲低混合穩(wěn)轉(zhuǎn)株，其是由多個(gè)單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)成的克隆群。因其外源片段的整合位點(diǎn)不同，不同的單克隆表達(dá)效率不同[5]。此外，由于體外細(xì)胞多屬于病胞系，其基因組呈現(xiàn)不確定的特點(diǎn)，即使是同類細(xì)胞，不同細(xì)胞個(gè)體基因組背景都存在差異。因此，本研究對前期ABCG1敲低細(xì)胞模型的構(gòu)建進(jìn)行改進(jìn)，通過有限稀釋法獲得了ABCG1敲低單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株，其為含有穩(wěn)定整合外源片段的單個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增，ABCG1的表達(dá)效率穩(wěn)定，且基因組背景相對單一，可去除細(xì)胞群體的干擾因素，進(jìn)一步減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾因素。

本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABCG1低表達(dá)巨噬細(xì)胞促凋亡基因Bok與Bid表達(dá)增高[6]，細(xì)胞凋亡加快。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其可能與ABCG1介導(dǎo)的氧化固醇外流密切相關(guān)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ABCG1低表達(dá)的巨噬細(xì)胞7-KC及7β-OHC外流減少，胞內(nèi)氧化固醇沉積增加。氧化固醇由膽固醇通過酶催化氧化途徑及非酶催化氧化途徑形成，在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中沉積可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。Tesoriere等[8-10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)7-KC及7β-OHC與巨噬細(xì)胞共孵育時(shí)，細(xì)胞氧化性DNA損傷增加，p21、Bax及細(xì)胞色素C表達(dá)水平增強(qiáng)，線粒體凋亡途徑激活，細(xì)胞凋亡增加。

巨噬細(xì)胞ABCG1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，而其對AS的作用，在多項(xiàng)動(dòng)物及臨床研究中結(jié)果并不一致，目前仍存在爭議[11]。Tarling等[12]發(fā)現(xiàn)ABCG1基因敲除小鼠AS病變區(qū)域巨噬細(xì)胞凋亡增加，粥樣斑塊體積縮小。以上研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，巨噬細(xì)胞ABCG1低表達(dá)造成胞內(nèi)氧化固醇堆積，加速細(xì)胞凋亡，可能是ABCG1低表達(dá)抗AS的相關(guān)機(jī)制。

利益沖突：無