范雪蓮，曾梓建，蔡志梁，張喬軒，石文，劉冬冬，林海標(biāo)

(1.廣州市海珠區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣州 510240；2.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣東東莞523808 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510120)

25羥維生素D[25(OH)D]是固醇類衍生物，也是人體生長(zhǎng)和發(fā)育過程中的必需元素。血液中25(OH)D的含量不僅在維持血清鈣濃度穩(wěn)定和骨骼健康方面起著重要的生理作用，還可作用于胰腺細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。25(OH)D含量與呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自身免疫病、腫瘤有關(guān)[1]。25(OH)D在體內(nèi)的主要存在形式為25羥維生素D2[25(OH)D2)]和25羥維生素D3[25(OH)D3][2]，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)血清中25(OH)D2和25(OH)D3水平，可準(zhǔn)確反映人體25(OH)D的營(yíng)養(yǎng)水平[3-4]。研究表明[5]，不同地區(qū)人體血清25(OH)D水平存在差異。但未見廣州地區(qū)相關(guān)報(bào)道，本研究通過對(duì)2 418例0～7歲兒童血清25(OH)D檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，初步了解廣州地區(qū)0～7歲兒童血清25(OH)D營(yíng)養(yǎng)狀況。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 選擇2018年2月至2019年6月在廣東省中醫(yī)院健康體檢的0～7歲兒童2 418例，其中男1 380例，女1 038例；季節(jié)劃分為：春季，3～5月；夏季，6～8月；秋季，9～11月；冬季，12～次年2月。所有研究對(duì)象身心健康，營(yíng)養(yǎng)狀況良好，肝腎功能正常，排除患有遺傳病、先天性疾病等基礎(chǔ)疾病以及近1個(gè)月內(nèi)有發(fā)熱等癥狀的兒童。

1.2標(biāo)本采集與處理 上午8:00—11:00采集研究對(duì)象空腹靜脈血標(biāo)本2～3 mL，2 h內(nèi)離心分離血清，-20 ℃保存。

1.3主要儀器與試劑 Waters TQ-S串聯(lián)ACQUITY UPLC液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，Agela Technologies氮?dú)獯蹈善?天津博納艾杰爾科技公司)，25(OH)D校準(zhǔn)液為美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 972a[25(OH)D2和25(OH)D3，溶劑型]和SRM 972a(4濃度水平，血清基質(zhì))。純度為98.0%的25(OH)D3-23,24,25,26,27-13C5(99原子%13C)和純度為99.3%的25(OH)D2-6,19,19-d3(99原子%13C)作為內(nèi)標(biāo)物(ISs)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。LC-MS級(jí)甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯(德國(guó)MereK公司)。硫酸鋅、甲酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。渦旋混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)，Eppendorf移液器(德國(guó)Eppendorf公司)，Thermo 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司)，Simplicity UA超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)等。

1.425(OH)D檢測(cè)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1樣本處理 分別取待測(cè)樣本血清于15 mL離心管中并進(jìn)行編號(hào)，然后分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻；往上述離心管中加入200 μL 0.2 mmol/L硫酸鋅溶液，振蕩混勻后室溫靜置10 min；加入500 μL甲醇震蕩混勻，蛋白質(zhì)沉淀后加入1 mL正己烷/乙酸乙酯(2∶1)渦旋震蕩1 min后在4 000 r/min條件下離心10 min；各取900 μL上清液于新的離心管中，氮?dú)獯蹈?；往離心管中加入200 μL 50%乙腈水復(fù)溶，4 000 r/min離心5 min，取上清液至進(jìn)樣瓶中并編號(hào)，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 分別取1、5、10、20、50和100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于15 mL離心管中并進(jìn)行編號(hào)，然后分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，取200 μL上述溶液于進(jìn)樣瓶中并編號(hào)，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 用LC-MS/MS測(cè)量25(OH)D2和25(OH)D3水平，根據(jù)血清25(OH)D2和25(OH)D3總量判斷維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況,當(dāng)25(OH)D水平<50 nmol/L(20 ng/L)為缺乏；50 nmol/L(20 ng/L)≤25(OH)D<75 nmol/L(30 ng/L)為不足；75 nmol/L(30 ng/L)≤25(OH)D為充足[6]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。用Kolmogorov-Smirnov test進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25，P75)描述；兩獨(dú)立樣本的比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；多個(gè)獨(dú)立樣本的比較先用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，相鄰組間兩兩比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.10～7歲兒童血清25(OH)D的總體分布 2 418例0～7歲兒童血清25(OH)D水平為36.1(29.5，44.8)ng/L，其中缺乏組113例，占4.7%，不足組534例占22.1%，充足組1 771例，占73.2%，25(OH)D處于較低水平的占26.8%。見表1。

表1 2 418例0～7歲兒童血清25(OH)D的分布

2.20～7歲兒童血清25(OH)D水平的性別間差異 0～7歲兒童血清25(OH)D水平男性高于女性(Z=-2.352，P=0.019)，且男性缺乏和不足比例低于女性，充足比例高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.591，P<0.05)。見表2。

表2 不同性別0～7歲兒童血清25(OH)D水平比較

2.30～7歲兒童血清25(OH)D水平的年齡間差異 0～7歲兒童血清25(OH)D水平隨年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；3～4歲、4～5歲、5～6歲、6～7歲血清25(OH)D水平均低于0～1歲、1～2歲、2～3歲(P均<0.05)；除5～6歲和6～7歲組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其他各相鄰組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；3～4歲、4～5歲、5～6歲、6～7歲血清25(OH)D缺乏和不足比例高于0～1歲、1～2歲、2～3歲，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同年齡0～7歲兒童血清25(OH)D水平比較

2.40～7歲兒童血清25(OH)D水平的季節(jié)間差異 0～7歲兒童夏季血清25(OH)D水平最高，冬季25(OH)D水平最低，春季和秋季比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。冬季25(OH)D缺乏比例高于其他季節(jié)，夏季25(OH)D缺乏和不足比例最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；春、秋季節(jié)25(OH)D水平以及缺乏、不足的比例接近。見表4。

表4 不同季節(jié)0～7歲兒童血清25(OH)D水平比較

2.5不同年齡0～7歲兒童血清25(OH)D2的檢出率 0～7歲兒童25(OH)D2共檢出346例，檢出率為14.3%，其中0～1歲兒童血清25(OH)D2檢出率高于其他年齡段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 0～7歲兒童血清25(OH)D2在不同年齡段的檢出率[n(%)]

2.60～7歲兒童血清25(OH)D2對(duì)評(píng)價(jià)維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的影響 若僅采用血清25(OH)D3水平評(píng)價(jià)0～7歲兒童維生素D水平，缺乏率為7.2%，不足率為24.6%，而25(OH)D2的檢出使0～7歲兒童總體維生素D充足比例共上升5%。分析346例檢出25(OH)D2的結(jié)果，25(OH)D2使血清維生素D缺乏率降低了17.4%，不足率降低了17.3%，充足率提高34.6%。見表6。

表6 0～7歲兒童血清25(OH)D2對(duì)評(píng)價(jià)維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的影響

3 討論

維生素D是人體正常發(fā)育必需的元素，其主要生理功能是維持血鈣及血磷的正常濃度[7]。維生素D還參與生殖、免疫、內(nèi)分泌等方面的調(diào)節(jié)[8]。維生素D缺乏目前在國(guó)內(nèi)外兒童中比較普遍，嚴(yán)重危害兒童的身體健康[9-10]。本研究通過分析0～7歲兒童血清25(OH)D水平與性別、年齡、季節(jié)的關(guān)系，了解廣州地區(qū)0～7歲兒童維生素D水平的營(yíng)養(yǎng)現(xiàn)狀，以期為科學(xué)防治兒童維生素D缺乏提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，2 418例0～7歲兒童中維生素D缺乏和不足比例占26.8%，與報(bào)道[11]一致。男童維生素D總體水平高于女童，且缺乏比例低于女童。戶外時(shí)間每天超過兩小時(shí)是維持維生素D正常水平的保護(hù)性因素[12]，男童相較于女童，更愿意參與戶外活動(dòng)，進(jìn)而提高了體內(nèi)維生素D水平。不同年齡的兒童之間，維生素D水平存在一定的差異，0～7歲兒童血清25(OH)D水平隨著年齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)?？赡茉?yàn)椋?～3歲兒童通過補(bǔ)充維生素D或食入奶粉等相對(duì)3～7歲攝入量更多；而3～7歲兒童可能由于偏食、入學(xué)后戶外活動(dòng)減少、機(jī)體對(duì)維生素D的需求增大等。結(jié)果還表明0～7歲兒童25(OH)D水平受季節(jié)的影響，夏季最高，冬季最低，春季和秋季水平接近。夏季兒童戶外接受紫外線照射的條件充足，而冬季兒童在戶外時(shí)間短，導(dǎo)致維生素D生成較少。廣州地區(qū)春秋季節(jié)不分明，可能受降雨的影響導(dǎo)致兒童戶外時(shí)間減少而使得25(OH)D水平低于夏季。

25(OH)D2的檢出對(duì)0～7歲兒童總體25(OH)D水平影響不大，僅使缺乏和不足比例共降低5%，但是在檢出的人群中可明顯減少25(OH)D的缺乏和不足比例。25(OH)D2的檢出有助于臨床精準(zhǔn)判斷25(OH)D營(yíng)養(yǎng)狀況并提供治療方案。目前維生素D檢測(cè)常用方法為免疫法和色譜法。免疫法在檢測(cè)維生素D時(shí)，各種25(OH)D代謝產(chǎn)物和類似物都能利用抗原抗體結(jié)合的原理發(fā)生反應(yīng)，故只能檢測(cè)25(OH)D總的濃度，而不能區(qū)分25(OH)D2和25(OH)D3[13]。本研究采用的LC-MS/MS同時(shí)具備液相色譜的高分理性和質(zhì)譜儀強(qiáng)大的分離鑒定能力，可區(qū)分25(OH)D2和25(OH)D3，對(duì)于醫(yī)生干預(yù)補(bǔ)充25(OH)D2有重要意義。

綜上所述，0～7歲兒童的維生素D水平與性別、年齡、季節(jié)有關(guān)。我們?cè)谂R床實(shí)際工作中，應(yīng)更加注重女童維生素D的補(bǔ)充，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)3～6歲兒童維生素D水平的重視，觀察其飲食習(xí)慣和戶外運(yùn)動(dòng)情況。在陽光不充足的季節(jié)，應(yīng)該及時(shí)對(duì)兒童維生素D水平進(jìn)行調(diào)查，補(bǔ)充適當(dāng)?shù)木S生素D制劑，以滿足身體需要。同時(shí)檢測(cè)25(OH)D2和25(OH)D3，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)人體維生素D水平，營(yíng)養(yǎng)狀況的評(píng)估以及疾病的發(fā)現(xiàn)和預(yù)防等有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。