吳曉聰，何建安，伍昌林，李華文，顧大勇

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東東莞523808；2.深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東深圳518033；3.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳518010；4.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院 深圳市第二人民醫(yī)院 a.輸血科，b.檢驗科，廣東深圳518035)

輸血成功依賴于準(zhǔn)確可靠的血液分型方法。目前有39個公認(rèn)的血型系統(tǒng)，血型抗原超過300個，最廣為人知的血型系統(tǒng)是ABO和RhD系統(tǒng)。這300多個血型抗原中許多具有重大臨床意義，如果分型不正確會導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的溶血性輸血反應(yīng)(hemolytic transfusion reaction，HTR)。血清學(xué)法、微柱凝膠卡法和PCR-序列特異性引物(sequence specific primer，SSP)等技術(shù)檢測血型，或需要標(biāo)記，或檢測周期長、檢測通量低，容易造成假陽性或假陰性。表面等離激元共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)被公認(rèn)為是“最好的無標(biāo)記生物檢測方法”。表面等離激元共振成像(surface plasmon resonance imaging，SPRi)技術(shù)與蛋白質(zhì)芯片技術(shù)結(jié)合，可以發(fā)揮二者的優(yōu)點(diǎn)，是一種全新的、精準(zhǔn)的檢測血型的免疫學(xué)診斷技術(shù)。

1 常用血型檢測方法

1.1免疫學(xué)法 玻片凝集法、試管凝集法、微量平板凝集法和凝膠柱凝集法[1-3]鑒定血型在檢測過程中容易受多種因素影響，結(jié)果判讀極易出錯，其操作難以實現(xiàn)規(guī)范化。目前，流行的量化方法是通過視覺對抗原抗體結(jié)合強(qiáng)度進(jìn)行初步分類，但由技術(shù)人員進(jìn)行分析量化的方法是主觀的、經(jīng)驗的、欠敏感的，且通過簡單的視覺分析來辨識弱交互作用通常很難。熒光輔助細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是2種可以定量分析紅細(xì)胞抗原與其相應(yīng)抗體相互作用的方法。但是這2種方法都需要雙鍵和單鍵交替的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生共軛效應(yīng)來激發(fā)熒光效果，會影響抗原抗體結(jié)合的活性。FACS使用帶有標(biāo)記的抗體，這種抗體發(fā)出明亮的熒光，可在特定波長下用光學(xué)顯微鏡觀察。同樣，F(xiàn)CM依賴于附在血細(xì)胞上的熒光標(biāo)記抗體，測量細(xì)胞通過激光時發(fā)出的光[4-5]。這些方法通常用于量化紅細(xì)胞表面表達(dá)的抗原位點(diǎn)的數(shù)量，并具有動力學(xué)分析能力。然而，由于抗體抗原復(fù)合物在用FACS或者FCM檢測熒光之前發(fā)生反應(yīng)，這2種方法都受到時間延遲分析的影響。因此，實時測量抗原抗體相互作用分析有限。

1.2基因分型檢測 目前使用的ABO血型基因分型技術(shù)可以分為2大類：檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)和檢測核苷酸序列。檢測SNP的技術(shù)包括：用SSP擴(kuò)增SNP片段的PCR-SSP技術(shù)，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與序列特異性寡核苷酸探針(sequence specific oligonucleotide probes，SSOP)雜交來鑒定相應(yīng)SNP片段的PCR-SSOP技術(shù)[6]。PCR-SSP和PCR-SSOP技術(shù)只能檢測出已知的SNP，因此可能漏檢未知的基因突變，這是該技術(shù)的先天性缺陷。此外，除非鑒定全部數(shù)以百計的已知SNP，否則可能得到錯誤的基因分型結(jié)果。在以PCR為基礎(chǔ)的測序分型技術(shù)(sequence based typing，SBT)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般含有2條單體型DNA，觀察到的測序圖是2條單體型核苷酸序列的加合，因此可能產(chǎn)生模棱兩可的分型結(jié)果。

分子克隆技術(shù)是將ABO血型基因克隆到載體后再測序，這樣每個克隆只含有1條單體型的基因片段，不存在模棱兩可的測序結(jié)果，但是整個過程比較費(fèi)時費(fèi)力，因此一般只用于驗證新發(fā)現(xiàn)的等位基因。

眾所周知，檢測出某個基因或其mRNA不能作為該基因所編碼的蛋白質(zhì)得到表達(dá)的直接指標(biāo)?；蚍中皖A(yù)測的血型表型，最終必須用血清學(xué)方法驗證，以避免潛在的定型錯誤。雖然血型基因分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于ABO血型基因分型，但是由于產(chǎn)生ABO亞型分子機(jī)制的多樣性，基因分型預(yù)測ABO亞型尚有一定的局限性。

1.3新型傳感器 SPR生物傳感器主要由光學(xué)檢測系統(tǒng)、傳感芯片、液流控制系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)和計算機(jī)軟件5部分元件組成。其中，傳感芯片是最核心的組件，傳感芯片提供了產(chǎn)生SPR信號的必需物理條件，且分子相互作用在傳感芯片表面進(jìn)行[7]。根據(jù)光學(xué)反射率變化的原理，SPR生物傳感器中生物分子在金(Au)表面吸附，導(dǎo)致活性金表面附近折射率發(fā)生變化，根據(jù)折射率的信號變化觀察生物分子的相互作用，通過監(jiān)測結(jié)合和解離過程中光學(xué)性質(zhì)的變化來研究分析動力學(xué)、親和力和濃度的定性及定量信息[8-9]。大多數(shù)細(xì)胞不適用于商用SPR儀器的微流控系統(tǒng)，而紅細(xì)胞具有高度變形性，適用于微流控系統(tǒng)。SPR技術(shù)可針對血液免疫學(xué)檢測需求，將具有高靈敏度優(yōu)點(diǎn)的SPRi技術(shù)與微流控芯片技術(shù)集成，發(fā)展成為滿足臨床需求的血液免疫分析儀。

2 SPR在血型鑒定中的應(yīng)用研究

2.1ABO+RhD血型鑒定 血型鑒定可利用SPR技術(shù)在傳感器表面固定相應(yīng)的血型抗原或抗體進(jìn)行檢測。Quinn等[10]首次報道了SPR在血型抗原和抗體中的應(yīng)用，利用相應(yīng)的血型IgM抗體修飾SPR傳感器表面，實現(xiàn)對紅細(xì)胞表面A、B抗原的檢測。雖然該方法對A、B抗原均有較好的選擇性，但由于不能完全解離結(jié)合材料或部分功能化表面被祛除導(dǎo)致表面再生能力較差。近年來，人們對SPR技術(shù)應(yīng)用于血型檢測進(jìn)行了大量研究，使傳感器表面再生得到了改善，并且增加了測量周期的次數(shù)，提高了該方法的可行性。Hungkamang等[11]使用微陣列傳感器芯片固定抗A和抗B，觀察抗體陣列與紅細(xì)胞表面A、B抗原之間的相互作用來對ABO血型進(jìn)行鑒定。他們使用SPRi進(jìn)行多重分析，降低了檢測成本、檢測時間和樣品消耗。將SPR應(yīng)用于血液分型中，還需要充分了解抗原抗體凝集強(qiáng)度的附加信息。依據(jù)粘附強(qiáng)度和壁面剪應(yīng)力(WSS)，粘附的紅細(xì)胞在剪切流條件下會以不同的細(xì)胞平均速度(Vc)被迫離開感興趣區(qū)域。根據(jù)紅細(xì)胞膜上攜帶的抗原與抗體的相互作用對細(xì)胞運(yùn)動的抵抗力，細(xì)胞平均速度(Vc)越高，凝集強(qiáng)度越低，相應(yīng)的抗原-抗體結(jié)合程度越低，否則相反。根據(jù)SPR信號隨時間的變化來計算Vc的凝集強(qiáng)度，可用于不同凝集素的定量分析[11]。Sudprasert等[12]利用固定化抗A、抗B抗體陣列與紅細(xì)胞膜表面抗原的相互作用，獲得了紅細(xì)胞與固定化抗體的凝集強(qiáng)度，其凝集強(qiáng)度與抗原-抗體相互作用的量或紅細(xì)胞粘附強(qiáng)度相對應(yīng)。Tangkawsakul等[13]利用抗A和抗B共價固定在由高折射率玻璃、Cytop膜層和金薄膜(Au)組成的LR-SPR生物傳感器芯片上來大量檢測分析物質(zhì)，即紅細(xì)胞。研究表明，LR-SPR芯片與常規(guī)短程SPR傳感器相比，靈敏度更高、表面再生效果更佳。結(jié)合微陣列技術(shù)，SPRi技術(shù)可發(fā)展成為高通量和多重分析的有效工具。

在驗血的時候，抗體有2種類型：(1)五聚IgM，(2)單抗IgG。根據(jù)血凝原理，紅細(xì)胞表面抗原與血型特異性IgM抗體發(fā)生結(jié)合，便于紅細(xì)胞凝集和陽性鑒定。但是與IgM抗體不同的是，IgG抗體與紅細(xì)胞結(jié)合時不出現(xiàn)凝集，需要使用額外的凝集試劑抗人IgG做陽性指示，即用IgG抗體對陽性紅細(xì)胞進(jìn)行致敏化，抗人IgG就能檢測到致敏紅細(xì)胞上的球蛋白分子Fc片段，從而檢測抗原是否存在，這被稱為間接抗球蛋白試驗(IAT)[5]。Krupin等[14]使用了長程表面等離子體激元波導(dǎo)，通過固定的抗A IgG抗體捕獲紅細(xì)胞上血型抗原A，檢測紅細(xì)胞表面抗原A和B。該系統(tǒng)允許在極低的細(xì)胞濃度樣品中捕獲紅細(xì)胞，捕獲檢測濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于觀察到的最低血細(xì)胞比容水平的濃度。Li等[15]構(gòu)建了在玻璃襯底上沉積納米金(GNPs)表面固定抗A和抗B的光學(xué)生物傳感器，該傳感器進(jìn)一步集成到含有2個獨(dú)立樣本細(xì)胞的微流控芯片中，與紫外可見光譜儀相結(jié)合，分別用于A、B、AB和O型血液的鑒定，建立了一種簡便、快速、可靠的ABO血型分型和紅細(xì)胞計數(shù)檢測方法。該方法用于血液分型具有較高的準(zhǔn)確性，用于紅細(xì)胞計數(shù)具有較高的敏感性。與傳統(tǒng)方法相比，該傳感器能夠同時進(jìn)行血型分型和紅細(xì)胞計數(shù)，有利于快速評價貧血[16-17]。與普通凝膠微柱測定相比，該測定方法更靈敏，需要的血液樣品較少、時間更短。因此，該檢測平臺有潛力對血型系統(tǒng)進(jìn)行定性和定量檢測，修飾其他常見紅細(xì)胞表面抗原的抗體，如Rh因子。此外，該傳感器有望實現(xiàn)全自動，從而達(dá)到省時、避免人為誤差的目的。

為了實現(xiàn)高效的基于SPR血液分型，需要一種更快速、更方便的抗體定向固定方法。經(jīng)典的右旋糖酐-水凝膠偶聯(lián)方法具有非特異性結(jié)合低、結(jié)合能力高、化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。然而，這種方法既繁瑣又耗時(2～3 d)，還需要技能熟練的操作員。而且固定的方法導(dǎo)致隨機(jī)抗體固定，因為空間位阻可能會影響抗體與抗原的結(jié)合能力。Zhou等[18]提出了一種新的方法來量化ABO血型，開發(fā)了一種基于波長干涉的SPRi傳感器，采用抗體結(jié)合蛋白修飾的SPR芯片直接固定血型抗體，形成檢測線陣列，當(dāng)血樣與抗A和抗B相互作用時，通過共振傾角的變化同時檢測4個紅細(xì)胞樣本。血液分型結(jié)果與微柱凝膠試驗結(jié)果一致，檢測時間包括芯片修改時間均小于1 h。該方法對紅細(xì)胞A和B的檢測量最低為每毫升2×106個細(xì)胞，比傳統(tǒng)的SPR血型傳感器具有更高的靈敏度。在緊急和資源限制的情況下，這種技術(shù)在快速診斷、移動保健和公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

Rh(D)抗原表型除了正常的D陽性和陰性表型外，還有多種D變異表型，如弱D、部分D和DEL型。Then 等[19]以D抗原為例探討了一種用通用的抗人IgG抗體來檢測紅細(xì)胞抗原的方法。該方法借鑒了間接抗球蛋白試驗(IAT)，使用抗人IgG抗體與致敏紅細(xì)胞量化出紅細(xì)胞與抗體(IgG)之間的相互作用，從而進(jìn)行血型分型檢測。該檢測表面可完全再生，在進(jìn)行100多次再生過程中，功能化表面幾乎沒有降解。他們也探討了SPR定量檢測血液中的弱抗原和部分抗原的潛力和敏感性[20]。該敏感性研究將抗人IgG抗體固定在金傳感器表面，然后使用SPR檢測兩種臨床上重要類型的弱D變體：弱D和部分D。相較于以往的研究，利用SPR實現(xiàn)了兩類弱D變體的檢測，提高了靈敏度，為血型抗體-抗原相互作用的識別、定量和分類開辟了巨大的新前景。

2.2Rh抗原及Duffy抗原檢測 Rh 血型系統(tǒng)是目前被國際輸血協(xié)會(ISBT)確認(rèn)的30多個紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最具復(fù)雜性和多態(tài)性的血型系統(tǒng)，在臨床輸血中其重要性僅次于 ABO 血型。Rh血型抗原除了D抗原具有很強(qiáng)的免疫原性外，C、c、E 和e抗原在輸血過程中也會引起溶血性輸血反應(yīng)以及新生兒溶血癥。Rh系統(tǒng)主要多態(tài)性為C/c、E/e。因此，設(shè)計抗C，抗c，抗E，抗e的單克隆抗體，可以構(gòu)建SPR檢測芯片來分析Rh血型抗原表型種類進(jìn)行血型檢測。Szittner等[21]展示了一個和臨床相關(guān)的血型抗體(A，B和Rh血型)組成的SPR陣列，只需少量的血液樣品處理，每個血樣本能夠在5 min內(nèi)進(jìn)行快速的血型表型分析，這為大量供輸血的樣本處理提供一種可行的替代經(jīng)典血型分型的方法。對照現(xiàn)有實驗室診斷的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在cspri-rbc芯片上配備8種主要血型抗體中的7種(A、B、D、C、c、E和K)，可對隨機(jī)供體樣本進(jìn)行重復(fù)分型，并且其分型以及再生能力都非常強(qiáng)，特異性抗體分型的數(shù)量至少可以增加到96種，還有至少可以對100個樣本進(jìn)行分型。除抗E/e單克隆抗體以及抗體特異性低會導(dǎo)致結(jié)果不一致外，所有抗體的分型結(jié)果與經(jīng)典血清學(xué)結(jié)果完全一致。該研究表明SPRi的傳感器表面可以固定多種RBC抗體，并且重復(fù)多次使用還能獲得所有樣本可靠的分型。但由于Rh血型系統(tǒng)抗原類型與A和B抗原在RBC上位置的差異，Rh抗原需要更長的溫育時間來與固定的抗體反應(yīng)，并且停止流動試驗可以促進(jìn)Rh抗原、跨膜蛋白和固定抗體之間的相互作用，而連續(xù)流動不能應(yīng)用于檢測分析。Pipatpanukul等[22]證實了這項技術(shù)的適用性，即AB和Rh血型特異性抗體可直接固定在傳感器羥甲基葡聚糖(CMD)改性的金表面上進(jìn)行紅細(xì)胞表面抗原的檢測。該研究通過固相固定試驗同時識別抗原，顯示了檢測Rh稀有血型系統(tǒng)的潛力，減少了手工操作的時間，簡化分析，提高了成本效率。

眾所周知，Duffy系統(tǒng)抗體-抗原之間的相互作用在血液系統(tǒng)中是比較弱的，與RhD血型相比，Duffy血型表達(dá)的抗原相對較少，并且具有完全不同的結(jié)構(gòu)。目前定量檢測Fya和Fyb抗原的方法并不十分敏感，這在分析弱的Fya和Fyb抗原抗體相互作用時受到了嚴(yán)重的限制。Then等[23]以Duffy血型(Fya和Fyb)作為模型探討了SPR技術(shù)在血液分型中檢測弱抗原抗體相互作用的價值，研究了一種抗人IgG Fc功能化傳感器表面來檢測Duffy抗原弱的相互作用。該研究表明抗體濃度的最低閾值是成功檢測的必要條件。在孵育階段使用濃縮的抗Fya和抗Fyb液，部分檢測成功。但是這些結(jié)果并不完全可復(fù)制，隨著時間的推移，Duffy抗原-抗體復(fù)合物發(fā)生了顯著的離解，而且影響SPR檢測Duffy抗原的因素有多種，包括抗體濃度、抗原表達(dá)和抗原結(jié)構(gòu)。這些弱、不穩(wěn)定和可逆的抗體-抗原相互作用限制了SPR檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。盡管存在這些障礙，但使用SPR技術(shù)成功檢測了陽性Duffy抗原。RBC結(jié)合檢測的實例表明，一旦能形成更強(qiáng)、更穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物，就可以進(jìn)行SPR分析和檢測。

2.3血小板抗體的篩查 輸注血小板可預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能缺陷引起的出血，但是患者多次輸血后，容易產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體，導(dǎo)致血小板輸注無效(PTR)[24]。血小板特異性抗體的檢測對血小板免疫性疾病的診斷具有重要意義。目前，血小板抗體檢測和鑒定的方法，主要是固相凝集法、單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)(MAIPA)和FCM等。MAIPA、固相凝集法的指示紅細(xì)胞的保存期短，易造成試劑浪費(fèi)等；免疫法易出現(xiàn)假陰性或假陽性，該方法進(jìn)行臨床檢測時需要較多混合的O型血小板，但血小板表面抗原的復(fù)雜性，抗原譜不明確，易造成抗體的漏檢。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)研究或采用新的檢測方法。Metzner等[25]報道了一種新開發(fā)的、易于操作的血小板抗體珠陣列(PABA)，用于檢測血小板特異性抗體的性能。PABA是一種將MACE技術(shù)與珠陣列技術(shù)相結(jié)合的檢測人血小板抗體的可靠的多重檢測平臺。該平臺將促進(jìn)實際鑒定血小板特異性抗體的常規(guī)檢測。伍昌林等[26]初步應(yīng)用SPR的非標(biāo)記技術(shù)在血小板抗體的篩選與配型中，他們采用氨基耦聯(lián)法在SPR傳感芯片表面固定相應(yīng)的通用型血小板抗原，實現(xiàn)了對相應(yīng)血小板抗體的檢測。但是，SPR技術(shù)是使用血小板譜抗原作為點(diǎn)樣抗原，由于抗原譜的復(fù)雜性，可能存在抗原譜不全面，從而出現(xiàn)血小板稀有抗體漏檢的問題。隨著基因組學(xué)與蛋白組學(xué)的發(fā)展，血小板抗原的全面檢測，該問題將會解決。隨著SPR技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展成熟，臨床應(yīng)用將更加簡便，可以直接篩查血小板抗體，通過配合試驗，選擇與受血者相合的血小板顯得更加容易，該技術(shù)將有望應(yīng)用于臨床日常檢測工作中。

3 總結(jié)與展望

SPR是一種無標(biāo)記的實時跟蹤分子相互作用的方法，利用固定在傳感器表面上的IgM或抗人IgG的特異性紅細(xì)胞抗體或血小板血型抗原來實現(xiàn)基于SPR的血液分型與鑒定，所述抗體或者抗原又用作捕獲血液分析物的配體，通過SPRi技術(shù)監(jiān)測微流控室中結(jié)合的分析物實現(xiàn)對ABO和RhD血型鑒定，Rh抗原及Duffy抗原檢測以及血小板抗體的篩查，從而進(jìn)行血型鑒定以及分型，并且可以循環(huán)再生使用。新型號的SPR生物傳感器還可以實現(xiàn)自動化，可以同時分析多個樣本，為定量的、多抗原的血液分型平臺提供了條件。不過SPR生物傳感器在定量分析研究中仍存在一些問題。目前大部分基于SPR生物傳感器的檢測方法都依賴于大型儀器，成本高昂，主要用于實驗室研究。許多檢測場合，如果取樣后送回實驗室分析，將降低檢測的速度和準(zhǔn)確性。因此，需要開發(fā)更便于攜帶的SPR生物傳感器，以推廣SPR技術(shù)在生活中的應(yīng)用。近年來，已有多個實驗室開展了便攜式SPR生物傳感器的研究[27-28]，隨著研究不斷深入，SPR技術(shù)在生活中的應(yīng)用將會越來越廣，隨著科技的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，該技術(shù)可結(jié)合其他技術(shù)，在臨床醫(yī)學(xué)檢測中達(dá)到更好的效果，解決更多的醫(yī)學(xué)難題，具有非常可觀的發(fā)展前景。