王力，陽(yáng)振曦，程焱，崔巍

(國(guó)家癌癥中心 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100021)

隨著ISO 15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可工作的不斷推進(jìn)以及實(shí)驗(yàn)室管理的逐步規(guī)范，驗(yàn)證血液分析儀的檢測(cè)性能已基本成為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)工作之一。按照衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》的相關(guān)規(guī)定，需驗(yàn)證的項(xiàng)目應(yīng)包括：本底計(jì)數(shù)、攜帶污染、精密度、正確度、線性、可比性等[1]。但是目前商品化的線性質(zhì)控物較少且缺乏有效的購(gòu)買(mǎi)渠道，大部分醫(yī)院在短期內(nèi)遇到涵蓋所有項(xiàng)目的臨床極端高值樣品的可能性很小，所以如何及時(shí)有效地進(jìn)行線性評(píng)價(jià)是目前血液分析儀性能驗(yàn)證工作中的一個(gè)難點(diǎn)[2]。為解決這一難題，現(xiàn)介紹一種可簡(jiǎn)單獲得血液分析儀高濃度線性驗(yàn)證樣品的方法供大家參考。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 XN-350血液分析儀及其配套試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品(日本Sysmex公司)。Heraeus Labofuge 400及Heraeus Multifuge 4 KR離心機(jī)(德國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.2標(biāo)本采集與處理 按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程[3]采集新鮮全血標(biāo)本，EDTA-K2抗凝，用于血常規(guī)檢測(cè)，完成檢測(cè)并留取備份后的剩余標(biāo)本用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.3方法

1.3.1高濃度紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血細(xì)胞比容(HCT)樣品的制備 選取當(dāng)天同血型全血標(biāo)本4份(RBC盡量>5.00×1012/L)，混合成2份后用Heraeus Multifuge 4 KR離心機(jī)2 000 r/min離心3 min；用一次性塑料吸管去除大部分血漿后將剩余血細(xì)胞混合于1支試管中，獲得約3 mL高濃度RBC、Hb和HCT樣品。

1.3.2高濃度白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)樣品的制備 (1)選取當(dāng)天全血標(biāo)本(ABO血型可能不同，盡量選取WBC和PLT測(cè)定結(jié)果較高的標(biāo)本，如WBC>15.00×109/L、PLT>250×109/L)40份，混合后倒入8支10 mL離心管中。(2)用Heraeus Labofuge 400離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，用一次性塑料吸管盡量提取中間富含WBC和PLT的白膜層(提取時(shí)會(huì)混有一定量的血漿、紅細(xì)胞)混合備用(約12 mL分裝至4支EDTA-K2抗凝真空采血管內(nèi))。(3)搖勻后放入Heraeus Multifuge 4 KR離心機(jī)中，再次3 000 r/min離心5～10 min，用一次性塑料吸管再次盡量提取中間白膜層混合備用(約6 mL分裝至2支EDTA-K2抗凝真空采血管內(nèi))。(4)重復(fù)步驟3，進(jìn)一步富集WBC和PLT，提高其濃度，得到約3 mL高濃度WBC和PLT樣品。

1.3.3線性驗(yàn)證樣品的制備與檢測(cè) 用XN-350血液分析儀配套稀釋液[4]將上述高濃度血細(xì)胞樣品分別按100%、80%、60%、40%、20%、10%、2%、0%的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯玫臉悠贩胖脻L軸混勻器上進(jìn)行混勻備用。每個(gè)稀釋度的樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》，按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 408—2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評(píng)價(jià)指南》的相關(guān)計(jì)算指標(biāo)以及公式等采用R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)分析線性數(shù)據(jù)[5]。首先，采用格拉布斯(Grubbs)法進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，剔除離群值。然后，對(duì)線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，確定最優(yōu)擬合方程；如數(shù)據(jù)擬合結(jié)果為統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性，則需按照指南中的公式計(jì)算最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值(average deviation from linearity，ADL)，并與臨界值進(jìn)行比較以判斷是否為臨床可接受的非線性。最后，按照指南中的公式計(jì)算數(shù)據(jù)的不精密度，與界值進(jìn)行比較從而檢驗(yàn)線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)的精密度，以保證多項(xiàng)回歸分析統(tǒng)計(jì)學(xué)的準(zhǔn)確性。具體計(jì)算公式參照指南中相應(yīng)內(nèi)容以及相關(guān)文獻(xiàn)資料[6]。

2 結(jié)果

2.1高濃度血細(xì)胞樣品的制備 將富集的高濃度血細(xì)胞樣品用Sysmex XN-350血液分析儀進(jìn)行初步檢測(cè)，RBC、Hb、HCT、WBC以及PLT的測(cè)定結(jié)果分別為8.34×1012/L、262 g/L、76.0%、293.00×109/L和2 387×109/L，達(dá)到預(yù)期要求。

2.2線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)及多項(xiàng)回歸分析結(jié)果 剔除離群值后對(duì)驗(yàn)證數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，各項(xiàng)目線性驗(yàn)證不同比例濃度樣品的測(cè)定值與最優(yōu)擬合值見(jiàn)表1。各項(xiàng)目線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)的多項(xiàng)回歸分析結(jié)果如圖1所示，Hb與PLT為一階線性，而RBC、HCT和WBC為二階線性，R2均在0.95以上。

表1 各項(xiàng)目線性驗(yàn)證不同濃度樣品的測(cè)定結(jié)果及最優(yōu)擬合值

注：A～E分別為RBC、Hb、HCT、WBC和PLT線性多項(xiàng)回歸分析結(jié)果。

2.3非線性程度判斷及精密度評(píng)價(jià) 從圖1中可看出RBC、HCT和WBC為統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性，需計(jì)算ADL值以判定是否為臨床可接受的非線性。RBC、HCT和WBC的ADL計(jì)算值分別為1.19%、0.95%和1.99%，均小于臨界值5.25%、5.28%和5.37%，為臨床可接受的非線性。RBC、Hb、HCT、WBC以及PLT線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)的不精密度評(píng)估值分別為0.73%、0.58%、0.84%、1.11%和1.39%，均小于判定界值9.76%，說(shuō)明數(shù)據(jù)的精密度良好，滿(mǎn)足線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)多項(xiàng)回歸分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

2.4線性范圍 各項(xiàng)目的實(shí)際驗(yàn)證線性范圍與廠家聲明的線性范圍見(jiàn)表2。由于WBC和PLT樣品制備濃度未達(dá)到廠家聲明的線性上限，導(dǎo)致實(shí)際驗(yàn)證線性范圍低于廠家聲明的線性范圍，但實(shí)際驗(yàn)證線性范圍也基本可滿(mǎn)足絕大部分臨床標(biāo)本的檢測(cè)需求。

表2 各項(xiàng)目的實(shí)際驗(yàn)證線性范圍與廠家聲明線性范圍

3 討論

利用臨床標(biāo)本分離PLT和WBC在血液分析儀線性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用雖已有報(bào)道[7-9]，但本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：(1)富集方法簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)，富集制備的樣品項(xiàng)目齊全、濃度值較高,可滿(mǎn)足大部分臨床檢測(cè)線性驗(yàn)證需求，并且一次富集可獲得多個(gè)項(xiàng)目同時(shí)呈現(xiàn)高濃度值的樣品，可在滿(mǎn)足線性驗(yàn)證濃度要求的同時(shí)節(jié)約檢測(cè)成本；(2)線性驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)分析方法科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，保證了線性驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

高濃度RBC樣品的制備相對(duì)簡(jiǎn)單，需要注意的是：因所需臨床標(biāo)本數(shù)量較少，推薦采用血型相同的臨床標(biāo)本；離心轉(zhuǎn)速不需要過(guò)高、時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免因離心力過(guò)大造成RBC的破損或因過(guò)度擠壓不易混勻，從而影響RBC和HCT的檢測(cè)結(jié)果。

制備高濃度WBC和PLT樣品成功的關(guān)鍵點(diǎn)在于：(1)離心轉(zhuǎn)速不易過(guò)低，以免離心后PLT處于血漿層而非中間白膜層，造成PLT的丟失；(2)提取中間白膜層時(shí)需操作熟練，減少WBC和PLT的丟失，從而提高富集的效率。雖然在選取臨床標(biāo)本時(shí)因所需標(biāo)本量較多而未采用同型血相混且富集后的樣品中仍含有一定量的RBC，但制備的樣品并未看到RBC有明顯的凝集或溶血現(xiàn)象。分析原因可能為：當(dāng)多份不同血型血液混合時(shí)，血漿中存在的血型物質(zhì)中和了部分血型抗體，從而抑制了血型抗體與紅細(xì)胞之間的凝集反應(yīng)[10]。

美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)H26-A2及EP6-A文件推薦可采用自身無(wú)細(xì)胞血漿、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或儀器廠商推薦的稀釋液對(duì)高濃度樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)瑏?lái)配制不同濃度水平的線性驗(yàn)證樣品[11-12]。本研究采用廠商推薦的可用于儀器預(yù)稀釋模式檢測(cè)的配套稀釋液對(duì)高濃度樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)欠駮?huì)造成高濃度樣品與低濃度樣品以及稀釋后的線性驗(yàn)證樣品與臨床常規(guī)標(biāo)本間基質(zhì)的不同，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步的研究探討。

本研究采用多項(xiàng)回歸分析對(duì)線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)Hb與PLT為一階線性，而RBC、HCT和WBC為臨床可接受的非線性；線性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的精密度均較好，可滿(mǎn)足線性評(píng)價(jià)的要求。