蔡小桃 張穎 韋麗麗 徐小萬(wàn) 謝炳春 莊澤岳 吳智明

辣椒ASR基因的克隆與表達(dá)分析

蔡小桃1，張 穎1，韋麗麗1，徐小萬(wàn)2，謝炳春1，莊澤岳1，吳智明1*

（1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣州 510225;2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

廣州 510640）

摘要：【目的】克隆辣椒ASR（ABA-stress-ripening）基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析并探究其在不同組織和非生物脅迫處理下的表達(dá)模式，為深入研究ASR基因家族在辣椒果實(shí)發(fā)育和逆境脅迫中的作用機(jī)制提供參考?！痉椒ā恳宰窭?號(hào)辣椒為材料克隆其ASR基因，對(duì)該基因家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其在不同組織及在ABA、高溫、高鹽和干旱脅迫處理下的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】克隆的2個(gè)辣椒ASR基因分別命名為CaASR2和CaASR3，基因全長(zhǎng)分別為987和938 bp，最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（ORF）分別為333和339 bp，分別編碼110和112個(gè)氨基酸，蛋白分子量分別為12.45和12.73 kD，理論等電點(diǎn)（pI）分別為7.47和6.50，均為親水性蛋白。結(jié)合前人克隆的辣椒CaASR1基因分析，結(jié)果顯示，CaASRs預(yù)測(cè)位于細(xì)胞核，均含有ABA/WDS特征結(jié)構(gòu)域;基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，辣椒ASR基因均含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，啟動(dòng)子區(qū)域均包含ABA響應(yīng)元件ABRE。CaASR1、CaASR2和CaASR3氨基酸序列分別與番茄（Solanum lycopersicum）基因組中的ASR蛋白氨基酸序列NP_001269248.1（80.20%）、NP_001307920.1（91.30%）和NP_001234137.1（96.43%）有非常高的相似性，表明其進(jìn)化的相對(duì)保守性。3個(gè)ASR基因在辣椒花中表達(dá)量最低，在根、莖、葉和種子中表達(dá)量中等，但均隨著果實(shí)的發(fā)育表達(dá)量逐漸升高，特別是在轉(zhuǎn)色和成熟果實(shí)中。ABA、高溫、高鹽和干旱脅迫處理下，基因的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），其中以CaASR3響應(yīng)最快，且上調(diào)表達(dá)量高于其他同源基因。【結(jié)論】辣椒基因組中3個(gè)ASR基因具有ASR基因家族的典型特征，并在辣椒不同組織和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 辣椒;ASR;果實(shí)發(fā)育;非生物脅迫;基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S641.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）11-3049-10

Cloning and expression analysis of ASR genes in pepper

（Capsicum annuum L.）

CAI Xiao-tao1， ZHANG Ying1， WEI Li-li1， XU Xiao-wan2， XIE Bing-chun1，

ZHUANG Ze-yue1， WU Zhi-ming1*

（1College of Horticulture and Landscape Architecture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou

510225， China; 2Vegetable Research Institute/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research

of Vegetables， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou? 510640， China）

Abstract：【Objective】ASR（ABA-stress-ripening） genes were cloned in this study. By bioinformatics analysis and expression analysis under different tissues and abiotic stress treatments， to provide a reference for further study on the mecha-nism of ASR gene family in pepper fruit development and abiotic stress. 【Method】ASR genes were cloned from Zunla-1 cultivar. A series of bioinformatics and phylogenetic analysis were carried out to evaluate the family members. The tissue specific expression patterns and the expression patterns under ABA， high temperature， high salt， and drought stress were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】Two ASR genes were cloned， named as CaASR2 and CaASR3. The full lengths of CaASR2 and CaASR3 were 987 and 938 bp， and the open reading frame（ORF） were 333 and 339 bp in length， which encoded 110 and 112 amino acids， respectively. Their molecular weights were 12.45 and 12.73 kD， and their theoretical isoelectric points（pI） were 7.47 and 6.50， respectively， and they were hydrophilic protein. The results showed that CaASRs were predicted to be in the nucleus and contained ABA/WDS（ABA/water de?cit stress） domain. All CaASRs genes contained two exons and one intron， and the promoter region contained ABA response element ABRE. The amino acid sequences of CaASR1， CaASR2 and CaASR3 were highly similar to? those of ASR protein amino acid NP_001269248.1（80.20%）， NP_001307920.1（91.30%） and NP_001234137.1（96.43%） in tomato（Solanum lycopersicum）， which indicated the relative conservation of evolution. The results of tissue specific expression analysis showed that they were expressed the lowest in flower， and the moderate in root， stem， leaf， and seed， gradually increased with fruit grew， and especially highly expressed in color-changing fruit and mature fruit. The expression levels were significantly increased under ABA stress， high temperature， high salt and drought（P<0.05）， and CaASR3 had the fastest response， whose up regulated expression levels were higher than that of other homologous genes. 【Conclusion】Three ASR genes in pepper genome have typical characteristics of the ASR family and play important roles in different tissue and abiotic stress resistance in pepper.

Key words： pepper（Capsicum annuum L.）; ASR（ABA-stress-ripening）; fruit development; abiotic stress; gene expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32072598）; The Characteristic Innovation Project of Colleges and Universities in Guangdong（2018KTSCX099）

0 引言

【研究意義】辣椒（Capsicum annuum L.）富含維生素C和辣椒素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，品種資源豐富，栽培適應(yīng)性廣，在保證我國(guó)蔬菜周年均衡供應(yīng)、農(nóng)民增收與脫貧致富中發(fā)揮了重要作用。2018年我國(guó)辣椒播種面積已達(dá)213.3萬(wàn)ha，年產(chǎn)值約2500億元，是我國(guó)栽培面積最大和經(jīng)濟(jì)效益最高的蔬菜作物之一（鄒學(xué)校等，2020）。由于栽培范圍廣，加上近年來(lái)氣候的劇烈變化，高溫、干旱及土壤鹽漬化等逆境嚴(yán)重影響了辣椒栽培生產(chǎn)，帶來(lái)巨大損失。ASR（Abscisic acid-，stress- and ripening-induced）蛋白是一類(lèi)植物特有的親水性蛋白，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用（González and Iusem，2014）?？寺〔⑸钊胙芯緼SR基因的特征、進(jìn)化和表達(dá)模式，對(duì)辣椒豐產(chǎn)和抗逆性改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ASR基因家族是從種子植物進(jìn)化而來(lái)，首次在番茄果實(shí)中被鑒定（Iusem et al.，1993），隨后在單子葉和雙子葉植物均有發(fā)現(xiàn)ASR蛋白，海岸生長(zhǎng)的鹽生植物海蓬子（Salicornia brachiata）也鑒定出含ASR基因（Jha et al.，2012），這些同源基因主要受水分虧缺、鹽脅迫、激素脫落酸（ABA）、低溫和光強(qiáng)的調(diào)控。在不同物種中，ASR基因的數(shù)量不同，如水稻（Oryza sativa）ASR基因家族有6個(gè)已知成員（Philippe et al.，2010），番茄（Solanum lycopersicum）有5個(gè)成員（Frankel et al.，2006），葡萄（Vitis vinifera）僅1個(gè)已知成員（?akir et al.，2003），玉米（Zea mays）則多達(dá)9個(gè)成員（Virlouvet et al.，2011）;而在十字花科植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中缺失（Carrari et al.，2004）。研究發(fā)現(xiàn)，ASR蛋白大多包含2個(gè)高度保守的區(qū)域：N端富含6～7個(gè)組氨酸殘基區(qū)域，C端約70個(gè)氨基酸殘基和核定位信號(hào)肽區(qū)域，核定位信號(hào)NLS已被證明無(wú)功能（Ricardi et al.，2012），亞細(xì)胞定位研究證實(shí)大多數(shù)植物ASR蛋白主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。ASR蛋白的另一個(gè)顯著特征是包含1個(gè)特有的保守ABA/WDS（ABA/water-de?cit stress）氨基酸結(jié)構(gòu)域，其以基因家族的形式存在。大多數(shù)植物ASR基因很短，編碼低分子量蛋白，通常作為糖、脫落酸和脅迫信號(hào)通路的共同成分，并參與果實(shí)發(fā)育和糖代謝等植物生命活動(dòng)的許多過(guò)程，但ASR基因的生理作用和調(diào)控機(jī)制尚未明確（程維舜等，2013）。ASR蛋白還作為轉(zhuǎn)錄因子影響植物代謝，如水稻中OsASR5蛋白調(diào)節(jié)保護(hù)細(xì)胞免受Al誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)（Arenhart et al.，2013）。Huang等（2020）發(fā)現(xiàn)CaASR1（Capana04g001289）作為一個(gè)正調(diào)控因子能與CabZIP63相互作用，加強(qiáng)辣椒對(duì)青枯病的抗性。對(duì)番茄ASR基因進(jìn)行的表觀遺傳試驗(yàn)證明，水分脅迫會(huì)引起表觀遺傳標(biāo)記的變化（González et al.，2011）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究辣椒ASR基因家族的生物學(xué)功能，對(duì)于闡述辣椒果實(shí)成熟和對(duì)不利環(huán)境的耐受性機(jī)制具有重要意義。辣椒中有關(guān)ASR基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此本課題組前期基于測(cè)序的辣椒基因組信息，通過(guò)同源性比對(duì)方法，從遵辣1號(hào)辣椒基因組中鑒定到3個(gè)ASR基因成員（基因ID分別為Capana04g001287、Capana04g001288和Capana04g00 1289），并初步分析了其在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)（張圣旭，2016）?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用生物信息學(xué)手段全面分析ASR基因家族的特征，檢測(cè)其在不同組織及在ABA處理和多種非生物脅迫下的表達(dá)模式，為后續(xù)研究ASR基因家族在辣椒生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫中的功能機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

辣椒自交系ZY35和遵辣1號(hào)品種分別由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所和遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院辣椒研究所提供。植物RNA提取試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司;2×Hieff Robust PCR Master Mix，Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，2×Hieff Canace Gold PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液，以及Hieff clone zero TOPO-Blunt Cloning Kit等試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司;膠回收試劑盒E.Z.N.A. Gel Extraction Kit和質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini KitⅠprotocal-spin protocol購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司;熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自日本TaKaRa公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：5810 R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）;PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）;4100凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）;熒光定量PCR儀CFX ConnectTM Real-Time System（Bio-Rad，美國(guó)）。

1. 2 樣品采集及脅迫處理

辣椒自交系ZY35于2020年8月進(jìn)行播種，9月露地定植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地，盛果期從5個(gè)單株上采取根、莖、葉、花、幼果、轉(zhuǎn)色期果實(shí)、成熟果和種子等組織，每個(gè)組織樣品分成3份，用于熒光定量分析。于2021年1月將遵辣1號(hào)種子浸泡過(guò)夜，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，種子發(fā)芽后播種于塑料營(yíng)養(yǎng)缽，在塑料大棚內(nèi)養(yǎng)護(hù)，待長(zhǎng)至6片真葉時(shí)（約40 d），選取生長(zhǎng)勢(shì)良好、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）、干旱脅迫（400 mmol/L甘露醇）、高溫脅迫（42 ℃）和ABA脅迫（30 μmol/L ABA）4個(gè)處理，以正常栽培下清水澆灌處理作為對(duì)照（CK）。每組處理10棵幼苗，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。處理0、3、6、12和24 h后取辣椒第3～4片葉用于非生物脅迫后續(xù)基因定量分析。辣椒組織樣品經(jīng)液氮速凍后立即放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 基因克隆與測(cè)序

自交系ZY35辣椒果實(shí)總DNA的提取參照CTAB法（王關(guān)林和方宏筠，2014）。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取不同組織和逆境處理下葉片的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量后利用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存在-20 ℃冰箱備用。根據(jù)遵辣1號(hào)基因組網(wǎng)站（https：//www.solgenomics.net/）下載已有的辣椒ASR基因（登錄號(hào)Capana04g001287和Capana04g001288）序列信息（Qin et al.，2014），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)合成基因全長(zhǎng)擴(kuò)增的上、下游引物（表1），分別以自交系ZY35辣椒果實(shí)的DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板2.0 μL，上、下游引物各2.5 μL，Gold Mix 25.0 μL;ddH2O補(bǔ)至50.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s，68 ℃退火30 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定條帶大小正確，進(jìn)行膠回收。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明，將純化產(chǎn)物連接到pESI-Blunt載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，挑選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN 6.0進(jìn)行比對(duì)。

1. 4 基因表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)分析，以Actin為內(nèi)參，引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);從65 ℃到95 ℃每0.5 ℃依次讀板，繪制溶解曲線(xiàn)。每個(gè)樣品在在同一板中重復(fù)3次，作為技術(shù)重復(fù)。

1. 5 辣椒ASR基因家族生物信息學(xué)分析

利用ExPASy（https：//www.expasy.org/protparam）在線(xiàn)分析工具ProtParam統(tǒng)計(jì)辣椒ASR家族蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)（pI）、穩(wěn)定性及親/疏水性等理化性質(zhì)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)CDD（Conserved domain database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。利用GSDS網(wǎng)站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖，在BUSCA（busca.biocomp.unibo.it）在線(xiàn)網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。運(yùn)用PRABI和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)ASR蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。提取辣椒ASR基因家族成員起始密碼子上游2000 bp基因組序列，利用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/web-tools/plantcare）網(wǎng)站在線(xiàn)分析啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件，之后在GSDS網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件可視化。

為分析辣椒ASR蛋白與不同物種間的親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取水稻、玉米、番茄和葡萄的ASR家族蛋白質(zhì)序列。利用MEGA-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采取鄰接法（Neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap method設(shè)置為1000。應(yīng)用在線(xiàn)網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org）預(yù)測(cè)分析所有蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，搜尋motif值為7，結(jié)構(gòu)域?qū)挾仍O(shè)定最小為10、最大為100，其他設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)。最后通過(guò)TBtools V1.09854（Chen et al.，2020）進(jìn)行可視化拼接。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

采集的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2002）。使用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 辣椒ASR基因的克隆與測(cè)序

根據(jù)辣椒ASR基因的CDS序列和基因組序列，設(shè)計(jì)定量PCR特異引物。分別以cDNA和DNA為模板，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含辣椒ASR基因完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的全長(zhǎng)基因（圖1）。將擴(kuò)增的片段克隆后測(cè)序，將測(cè)序序列與辣椒數(shù)據(jù)庫(kù)中ORF參考序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，該基因的ORF序列和全長(zhǎng)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列完全一致。將登錄號(hào)為Capana04g001287的基因命名為CaASR2，Capana04g 001288命名為CaASR3。CaASR2基因全長(zhǎng)為987 bp，最大ORF長(zhǎng)333 bp，CaASR3全長(zhǎng)938 bp，ORF長(zhǎng)339 bp。

2. 2 ASR編碼蛋白的序列特征

通過(guò)ExPASy工具進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果（表2）顯示，CaASR1、CaASR2和CaASR3分別編碼279、110和112個(gè)氨基酸，分子量分別為30.49、12.45和12.73 kD，pI分別為5.17、7.47和6.5，親水性平均系數(shù)均為負(fù)值，均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示辣椒3個(gè)ASR蛋白均位于細(xì)胞核內(nèi)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具CDD MbACO2蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)其含保守結(jié)構(gòu)域PLN02299，故推測(cè)MbA-CO2屬于ACO家族成員。多重比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示，辣椒ASR基因C端均含有保守ABA/WDS結(jié)構(gòu)域。

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，CaASR1蛋白占比在前5位的氨基酸依次為Gly（G）、Glu（E）、Thr（T）、Lys（K）和Ala（A），分別占15.8%、14.3%、12.5%、11.1%和7.2%。CaASR2蛋白占比在前5位的氨基酸依次為His（H）、Lys（K）、Ala（A）、Glu（E）和Gly（G），分別占22.7%、15.5%、15.5%、12.7%和8.2%。CaASR3蛋白占比在前5位的氨基酸依次為His（H）、Glu（E）、Ala（A）、Lys（K）和Gly（G），分別占19.6%、17.0%、16.1%、15.2%和8.0%。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果（圖4）表明，CaASR1蛋白包含：67個(gè)α-螺旋，占24.01%;20個(gè)延伸鏈，占7.17%;12個(gè)β-轉(zhuǎn)角，占4.30%;180個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，占64.52%。CaASR2蛋白包含：64個(gè)α-螺旋，占58.18%;8個(gè)延伸鏈，占7.27%;10個(gè)β-轉(zhuǎn)角，占9.09%;28個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，占25.45%。CaASR3蛋白包含：65個(gè)α-螺旋，占56.25%;10個(gè)延伸鏈，占8.93%;8個(gè)β-轉(zhuǎn)角，占7.14%;31個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，占27.68%。利用SWISS-MODEL對(duì)ASR蛋白進(jìn)行同源建模，獲得其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖5。

2. 3 辣椒ASR基因結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

利用GSDS網(wǎng)絡(luò)對(duì)ASR基因成員的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)辣椒中的3個(gè)ASR基因均含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子（圖6-A）。對(duì)辣椒ASR基因家族啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)辣椒ASR基因除包含真核生物共有的順式調(diào)控元件（TATA框和CAAT框）外，還包括一些與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件，即ABA響應(yīng)元件ABRE及厭氧誘導(dǎo)（ARE）、低溫（LTR）、干旱誘導(dǎo)相關(guān)MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS）等元件（圖6-B），這些順式作用元件決定了該基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)機(jī)制。

2. 4 辣椒ASR蛋白質(zhì)進(jìn)化和保守基序分析

為了解辣椒ASR基因家族的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載玉米、水稻、番茄和葡萄ASR家族蛋白序列，通過(guò)MEGA-X軟件構(gòu)建辣椒與玉米、水稻、番茄和葡萄ASR家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7-A）。結(jié)果顯示，24個(gè)ASR蛋白序列相似，與辣椒CaASRs基因遺傳背景相近的是番茄和葡萄2個(gè)物種，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的是水稻和玉米。同時(shí)CaASR2和CaASR3的親緣關(guān)系較近。CaASR1、CaASR2和CaASR3氨基酸序列分別與番茄基因組中的ASR蛋白氨基酸序列NP_001269248.1（80.20%）、NP_001307920.1（91.3%）和NP_001234137.1（96.43%）有非常高的相似性。保守基序統(tǒng)計(jì)分析，共識(shí)別到7個(gè)motif（保守基序），并依次命名為motif1～motif7（圖7-B）。其中motif1～ motif4最為保守，在所有辣椒ASR基因中均存在。CaASR2和CaASR3功能序列的數(shù)量和位點(diǎn)基本一致，具有高度保守性，推測(cè)其功能單位基本相似。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因均含有motif1～motif4，CaASR1還含有motif5和motif6。表明同一進(jìn)化簇成員間具有相似的保守結(jié)構(gòu)域組成，而不同簇具有各自特異的保守結(jié)構(gòu)域，可能與其具體的生物學(xué)功能相關(guān)。

2. 5 CaASRs基因的組織特異性表達(dá)分析

為充分了解CaASR基因在辣椒不同組織中的表達(dá)模式，分別以自交系ZY35辣椒的根、莖、葉、花、幼果、轉(zhuǎn)色期果實(shí)、成熟果實(shí)和種子的cDNA為模板，對(duì)CaASRs基因表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果（圖8）顯示，3個(gè)ASR基因呈現(xiàn)相對(duì)一致的組織特異性表達(dá)，即在辣椒花中表達(dá)量最低，其次是在根中表達(dá)量相對(duì)較低，在莖、葉和種子中表達(dá)量中等，在果實(shí)中最高。CaASR1隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)量逐漸升高，在成熟果實(shí)中表達(dá)量比幼果增加30倍。CaASR2和CaASR3均在轉(zhuǎn)色期果實(shí)中表達(dá)量最高，在成熟果實(shí)中的表達(dá)量反而顯著降低（P<0.05，下同）。說(shuō)明CaASR2和CaASR3在果實(shí)發(fā)育早期被誘導(dǎo)表達(dá)，CaASR1在果實(shí)成熟后期表現(xiàn)高表達(dá)量。綜上所述，推測(cè)ASR基因可能參與辣椒的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，特別是在辣椒果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

2. 6 CaASRs基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

對(duì)辣椒ASR基因在42 ℃高溫、甘露醇誘導(dǎo)的干旱脅迫、ABA噴施和NaCl脅迫處理下葉片中表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖9）表明，辣椒在4組非生物脅迫下，3個(gè)ASR基因均表達(dá)量上調(diào)，表達(dá)模式存在差異，其中，CaASR3的表達(dá)量相對(duì)于其他2個(gè)基因上調(diào)更多。CaASR1在處理后表達(dá)水平先上調(diào)，隨后恢復(fù)至對(duì)照水平，表達(dá)量均在12 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間段，在4組不同處理中呈現(xiàn)相對(duì)一致的表達(dá)模式;CaASR2在ABA和干旱處理下，表達(dá)量在6 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間段，在鹽脅迫和高溫處理下，24 h時(shí)仍具有相對(duì)較高的表達(dá)量。CaASR3基因在處理3 h后就開(kāi)始表達(dá)量上調(diào)，響應(yīng)快于其他同源基因;12 h后已經(jīng)下降，恢復(fù)至對(duì)照水平，在4組處理中表達(dá)量趨勢(shì)也呈現(xiàn)相對(duì)一致。推測(cè)CaASRs在辣椒抵御鹽脅迫、干旱脅迫及氧化脅迫中可能發(fā)揮正向調(diào)控功能。

3 討論

ASR基因作為一個(gè)小的基因家族，最早從成熟的番茄果實(shí)中分離，其在果實(shí)的發(fā)育與成熟、非生物脅迫和ABA應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，在馬鈴薯（Dóczi et al.，2005）、草莓（Chen et al.，2011）、番茄（Ricardi et al.，2014）、玉米（Li et al.，2018）和水稻（Park et al.，2020）等多種作物中均有報(bào)道。辣椒基因組中包含3個(gè)ASR基因，均含1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子的典型結(jié)構(gòu)和保守的ABA/WDS氨基酸結(jié)構(gòu)域，基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且相似，并呈串聯(lián)重復(fù)分布于辣椒第4號(hào)染色體上。進(jìn)化分析結(jié)果表明，辣椒ASR基因與番茄基因組中的ASR蛋白氨基酸序列同源性最近。3個(gè)ASR蛋白預(yù)測(cè)均位于細(xì)胞核內(nèi)，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)相似，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，該結(jié)果與Golan等（2014）研究所得的ASR序列特征相似，辣椒中該基因家族具有ASR蛋白的主要特征。

ASR基因在植物中存在組織特異性表達(dá)，不同成員可能在不同的器官、環(huán)境條件和表達(dá)模式中差異表達(dá)（Wang et al.，2016;Li et al.，2020）。組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明，CaASRs基因在莖、葉和種子中表達(dá)量高，在根中表達(dá)量相對(duì)較低，在花中表達(dá)量最低，該基因家族3個(gè)成員在正常生理?xiàng)l件下具有廣泛的表達(dá)模式。ASR基因在不同組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，暗示了ASR基因家族功能的復(fù)雜性。然而CaASR1隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)量逐漸升高，在成熟果實(shí)中表達(dá)量達(dá)最高值;CaASR2和CaASR3均在轉(zhuǎn)色期果實(shí)中表達(dá)量最高，高于其他組織。?akir等（2003）通過(guò)酵母單雜交試驗(yàn)表明，葡萄ASR蛋白與己糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，作為參與糖代謝的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。Chen等（2011）發(fā)現(xiàn)草莓果實(shí)中增加內(nèi)源ABA含量，F(xiàn)aASR在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)增加，可能對(duì)草莓果實(shí)成熟有一定的促進(jìn)作用。辣椒是非呼吸躍變型果實(shí)，已有研究證明ABA含量隨糖分積累和果實(shí)成熟逐漸積累，導(dǎo)致果實(shí)成熟過(guò)程中ASR基因大量表達(dá)。ASR基因在辣椒果實(shí)特異高表達(dá)，推測(cè)其在辣椒果實(shí)發(fā)育與成熟過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

關(guān)于ASR基因在逆境脅迫中的研究較多。最早從番茄中分離的ASR基因顯示，該基因的表達(dá)受脫水處理、ABA、茉莉酸甲酯和水楊酸的誘導(dǎo)，導(dǎo)致植物體對(duì)水和滲透脅迫有更高的耐受性。在煙草中過(guò)量表達(dá)番茄ASR1增強(qiáng)了煙草對(duì)高鹽脅迫的耐受性（Fischer et al.，2011）。水稻ASR1（OsAsr1）基因受鹽、甘露醇和ABA誘導(dǎo)，OsAsr1轉(zhuǎn)入酵母中能增強(qiáng)酵母對(duì)NaCl、雙氧水、硫酸、水楊酸和熱等脅迫的耐受性（Kim et al.，2009）。香蕉MaASR1在擬南芥中表達(dá)后使植株變小、葉片變小且變厚、抗旱性增強(qiáng)，同時(shí)能增強(qiáng)擬南芥對(duì)ABA信號(hào)的敏感性（苗紅霞等，2014）。在擬南芥中過(guò)表達(dá)玉米ZmASR3基因能顯著提高植株抗?jié)B透脅迫能力，增加ABA含量（Liang et al.，2019）。通過(guò)分析CaASRs在ABA、干旱、高鹽和高溫脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)多種處理時(shí)，ASR基因在辣椒葉片中的表達(dá)量整體呈升高趨勢(shì)，表達(dá)受非生物脅迫的共同調(diào)控，與辣椒的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。已有研究證明ABA處理可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上誘導(dǎo)ASR的表達(dá)，上游順式作用元件分析和RT-qPCR結(jié)果表明ABA參與非生物脅迫下辣椒ASR基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，推斷CaASRs基因可提高辣椒對(duì)非生物脅迫的耐受性，但有待進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)CaASRs驗(yàn)證其功能。

4 結(jié)論

辣椒基因組中含3個(gè)ASR基因，是一個(gè)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的小基因家族，進(jìn)化非常保守。辣椒ASR基因的表達(dá)具有組織特異性，在果實(shí)中表達(dá)量最高。在ABA、高鹽、干旱和高溫等非生物逆境脅迫下，CaASRs基因被誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)ASR基因家族在辣椒果實(shí)成熟和抗逆過(guò)程起重要作用。

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收稿日期：2021-05-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32072598）;廣東省普通高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目（2018KTSCX099）

通訊作者：吳智明（1981-），https：//orcid.org/0000-0001-8988-6060，博士，教授，主要從事蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種研究工作，E-mail：wuzm2012@zhku.edu.cn

第一作者：蔡小桃（1996-），https：//orcid.org/0000-0001-7165-7075，研究方向?yàn)槭卟松锛夹g(shù)，E-mail：2392023499@qq.com