司朝霞，韓 文

（山東濰坊市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濰坊261021）

0 引言

血液是人體內(nèi)全身循環(huán)流動(dòng)的組織液體，當(dāng)人體產(chǎn)生生理或病理性病變時(shí)，血液中的組分或物理性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化[1]，因此血液組分和物理特性檢測(cè)對(duì)分析人體生理或病理狀態(tài)具有重要意義，且血液檢測(cè)也是當(dāng)前臨床最重要、最常用的診斷依據(jù)[2]。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科血液檢測(cè)需要經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的排隊(duì)等待，且檢測(cè)結(jié)果等候時(shí)間為幾個(gè)小時(shí)到幾天不等，醫(yī)生和患者都無(wú)法第一時(shí)間得到檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)于血液樣本量有一定要求，過(guò)少的血液量無(wú)法獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，往往需要多達(dá)幾十毫升的抽血量，這對(duì)于體弱、病重患者會(huì)造成一定程度的二次傷害。因此，開(kāi)展少樣品、多項(xiàng)目集成血液檢測(cè)技術(shù)的研究具有重要意義[3]。

20世紀(jì)八九十年代，微流控芯片技術(shù)開(kāi)始興起[4-5]，并逐漸在DNA芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室、微進(jìn)樣技術(shù)、微熱力學(xué)技術(shù)等方面得到了發(fā)展[6-7]。其基本原理是利用復(fù)雜的微流道結(jié)構(gòu)和微流控生物芯片調(diào)度控制技術(shù)使血液細(xì)胞以一定速度逐一通過(guò)給定的流道結(jié)構(gòu)，進(jìn)行特定的檢驗(yàn)項(xiàng)目，能夠?qū)崿F(xiàn)小樣本情況下多檢測(cè)項(xiàng)目的整合，大大減少血液樣品的需求量，同時(shí)也能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)[8]。該技術(shù)可將血液檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中所需要的樣品處理、儀器檢測(cè)和人員操作標(biāo)準(zhǔn)化地集成在微小芯片上，并進(jìn)行封裝和操作簡(jiǎn)化，同時(shí)結(jié)合微創(chuàng)無(wú)菌采血技術(shù)，使得“便攜式”“傻瓜式”和“實(shí)時(shí)性”血液檢測(cè)成為可能[9-10]。微流控芯片技術(shù)屬于分子生物學(xué)、分析化學(xué)、微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)制造等多學(xué)科交叉技術(shù)，當(dāng)前還處于實(shí)驗(yàn)室或臨床試驗(yàn)階段，離大規(guī)模普及應(yīng)用還有一定距離，但是其作為一種新型快速模式化檢測(cè)手段具有廣闊的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。本文將對(duì)微流控芯片的基本原理、制造工藝以及其在血液檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行分析，并對(duì)未來(lái)研究趨勢(shì)和需要攻克的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行展望。

1 微流控技術(shù)的基本原理和優(yōu)勢(shì)

微流控技術(shù)是一種以在微納米尺度空間中對(duì)流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)[11]，它能將生化實(shí)驗(yàn)室的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本功能縮微到便攜式微小芯片上，實(shí)現(xiàn)多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺(tái)上的靈活組合、規(guī)模集成，其典型結(jié)構(gòu)及基本原理如圖1所示[12]。微流控是一個(gè)涉及了工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、微加工和生物工程等多個(gè)領(lǐng)域的新興交叉學(xué)科。

圖1 典型微流控結(jié)構(gòu)和檢測(cè)原理圖[12]

結(jié)合當(dāng)前血液檢測(cè)存在的問(wèn)題和微流控的技術(shù)特點(diǎn)，將微流控技術(shù)引入到血液檢測(cè)領(lǐng)域具有如下優(yōu)勢(shì)：

（1）樣品和試劑消耗少，成本降低。使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測(cè)，降低檢測(cè)費(fèi)用，縮短分析時(shí)間。

（2）具有高通量特點(diǎn)[13]。微流控可以設(shè)計(jì)成為多流道，通過(guò)微流道網(wǎng)絡(luò)可以同時(shí)將待檢測(cè)樣本分流到多個(gè)反應(yīng)單位，同時(shí)反應(yīng)單元之間相互隔離，使各個(gè)反應(yīng)互不干擾，因此可以根據(jù)需要對(duì)同一個(gè)樣本平行進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)。

（3）污染少，檢測(cè)誤差小。由于微流控芯片的集成功能，原先在實(shí)驗(yàn)室里需要人工完成的各項(xiàng)操作全部集成到芯片上自動(dòng)完成，使樣本的污染降低到最低程度。

（4）集成結(jié)構(gòu)小巧、便攜。將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)檢測(cè)所需的離心、過(guò)濾、混合、反應(yīng)和檢測(cè)等功能整合在微型芯片上，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化封裝制備小體積的便攜式檢測(cè)設(shè)備，能夠隨身攜帶、快速檢測(cè)。

（5）降低了對(duì)專(zhuān)業(yè)醫(yī)護(hù)人員的依賴(lài)性。衛(wèi)生設(shè)施有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)不具備醫(yī)學(xué)檢測(cè)條件，特別是在流行病暴發(fā)時(shí)，能夠降低對(duì)檢測(cè)設(shè)備的依賴(lài)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、實(shí)地快速檢測(cè)。

2 微流控芯片制造工藝的研究現(xiàn)狀

根據(jù)被控液體形態(tài)，微流控可分為連續(xù)流體（continuous-flow microfluidics）和液滴微流控（droplet microfluidics）[14-17]。實(shí)現(xiàn)基于微流控技術(shù)的血液檢測(cè)需要首先獲得檢測(cè)所需微液流/微液滴，并實(shí)現(xiàn)對(duì)其精確控制。而微小液流和液滴的產(chǎn)生依賴(lài)于微流控系統(tǒng)工程中的微納米結(jié)構(gòu)，因此微流控芯片技術(shù)中非常重要的一方面便是微小結(jié)構(gòu)的高精度加工和微小液流/液滴的可控產(chǎn)生。對(duì)于微小結(jié)構(gòu)的精細(xì)加工則涉及到眾多光學(xué)加工工藝、精雕加工、三維增材制造等先進(jìn)技術(shù)領(lǐng)域，已有研究學(xué)者提出了諸多方案，但仍存在結(jié)構(gòu)尺寸過(guò)大、構(gòu)型設(shè)計(jì)受限嚴(yán)重等特征[18]。因此，尋求更高靈活性、低成本、快速實(shí)現(xiàn)的微結(jié)構(gòu)制造新工藝是微流控芯片技術(shù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

2.1 刻蝕微納加工技術(shù)

早期的微流道制造器件的主要原材料是硅片、玻璃等，因此蝕刻法是在上述基底上加工微流道的主要技術(shù)手段。隨著基底材料和微納加工技術(shù)的發(fā)展，蝕刻技術(shù)也從傳統(tǒng)的光刻蝕、濕法刻蝕等技術(shù)逐漸衍生出軟光刻、流動(dòng)刻蝕、激光刻蝕等全新微納加工方法[19-21]。Dendukuri等[20]通過(guò)采用基于液滴的流動(dòng)光刻法，基于微流控裝置進(jìn)行微流體顆粒制造。該方法可以用于復(fù)雜顆粒的制造，使顆粒能夠具備各種不同的形態(tài)和化學(xué)層次上的各向異性。李曉宇等[22]采用CO2激光器對(duì)聚甲基丙烯酸甲脂（polymethyl methacrylate，PMMA）板進(jìn)行刻蝕制備微流道，結(jié)果表明激光線能量密度與刻蝕微流道寬度兩者關(guān)系呈指數(shù)增長(zhǎng)，通過(guò)工藝優(yōu)化可以制備出尺寸小于200μm的微流道。Chung等[19]采用激光直寫(xiě)的方法燒蝕PMMA加工微流道，并分析激光的光斑直徑對(duì)微通道寬度、深度的影響。王中旺等[23]也進(jìn)行了超快激光直寫(xiě)PMMA制備微流道的燒蝕機(jī)理和工藝參數(shù)優(yōu)化研究，其試驗(yàn)原理及裝置如圖2所示，通過(guò)工藝參數(shù)優(yōu)化可以有效避免加工過(guò)程中微流道內(nèi)壁區(qū)域殘?jiān)逊e和氣泡隆起現(xiàn)象。

圖2 超快激光直寫(xiě)PMMA加工微流道示意圖[23]

2.2 微銑加工技術(shù)

近年來(lái)，精密微小機(jī)床技術(shù)的發(fā)展使得微納結(jié)構(gòu)的機(jī)械加工成為可能。利用微銑加工方法可加工出較復(fù)雜的截面形狀，加工后的微流道可直接封裝成為微流道芯片，或作為塑料成形的模板。微銑技術(shù)在微流道加工領(lǐng)域的應(yīng)用大大擴(kuò)展了基底材料選擇范圍，為微流控芯片提供了更廣闊的材料選擇空間。Wilson等[24]采用機(jī)械微加工制造具有復(fù)雜橫截面幾何形狀的微流道。首先使用微型銑削工具在平面金屬表面上制作半圓形圖案母模，然后通過(guò)兩步反向成型工藝將微銑削的圖案轉(zhuǎn)移到聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）上，成功制備了筆直的和蛇形的微流道。余劍武等[25]使用精密微銑削方式，在光滑PMMA表面上加工微溝槽、方柱、圓形及橢圓形陣列，并以水滴的接觸角和形狀作為表面疏水性的表征指標(biāo)，制備并優(yōu)化了微溝槽和橢圓形陣列復(fù)合疏水微納結(jié)構(gòu)。張金峰等[26]設(shè)計(jì)了高速微銑削實(shí)驗(yàn)，研究了微溝槽底面表面粗糙度和側(cè)壁殘留毛刺的變化規(guī)律，從理論角度引入了已加工表面的精確形成和質(zhì)量控制機(jī)理，為微流道高質(zhì)量加工提供了理論依據(jù)。

2.3 微納結(jié)構(gòu)增材制造

近年來(lái)，3D打印技術(shù)已經(jīng)跨越了許多學(xué)科，隨著微納結(jié)構(gòu)3D打印技術(shù)的發(fā)展[27-29]，其在微流控結(jié)構(gòu)中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)開(kāi)始逐漸顯現(xiàn)，例如簡(jiǎn)化具有不同高度或懸掛結(jié)構(gòu)的制造以及芯片材料的多樣化，使得設(shè)計(jì)具有更好的靈活性，并能更快地制造傳統(tǒng)工藝無(wú)法實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜微流控結(jié)構(gòu)。Nelson等[9]使用熔融沉積建模3D打印技術(shù)制備了具有透明結(jié)構(gòu)且生物相容性?xún)?yōu)良的微流控結(jié)構(gòu)，其流道尺寸最小可達(dá)40μm。Bilatto等[30]通過(guò)將立體平版印刷3D打印與噴墨打印相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了微流控芯片的快速3D打印，并利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)出了實(shí)現(xiàn)血漿分離的簡(jiǎn)易微流控芯片，該芯片可以集成到醫(yī)療保健/便攜式系統(tǒng)中進(jìn)行即時(shí)診斷。Cairone等[31]通過(guò)3D打印技術(shù)制備了PDMS微光流體芯片，該芯片可以在不使用任何外部光學(xué)設(shè)備的情況下，將激光束直接驅(qū)動(dòng)到微流道中的兩相流中，利用微流體和激光入射角度之間關(guān)系的不斷變化檢測(cè)到不同的信號(hào)電平。其基本原理[31]如圖3所示。

微流控芯片技術(shù)的發(fā)展實(shí)際上很大程度上受制于微納制造技術(shù)，實(shí)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)、器件、系統(tǒng)的生產(chǎn)和組裝對(duì)于實(shí)現(xiàn)微流控芯片高度集成化和多功能化具有重要意義。因此，微流控芯片技術(shù)發(fā)展必須緊跟微納制造技術(shù)發(fā)展前沿，特別是三維微納結(jié)構(gòu)制造系統(tǒng)的發(fā)展，將先進(jìn)微納制造技術(shù)納入到微流控芯片的研制中，逐漸實(shí)現(xiàn)微流控芯片系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化、功能集成化和成本低廉化。

圖3 3D打印PDMS微光流體芯片原理圖[31]

3 微流控芯片在血液檢測(cè)中應(yīng)用的研究現(xiàn)狀

隨著微流控芯片技術(shù)在結(jié)構(gòu)加工、流體控制、多功能檢測(cè)集成封裝等方面研究的深入，微流控芯片技術(shù)逐漸向功能實(shí)現(xiàn)和臨床驗(yàn)證等方向發(fā)展。近年來(lái)，微流控芯片技術(shù)應(yīng)用研究從簡(jiǎn)單的血型區(qū)分，到復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞識(shí)別、核酸快速檢測(cè)等領(lǐng)域都取得了良好的試驗(yàn)效果，為未來(lái)大規(guī)模臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

3.1 血液分型和血液疾病的初步篩查

Lin等[3]設(shè)計(jì)了一種便攜式和一次性使用的微流控芯片，用于血液分型和血液疾病的初步篩查。該芯片能夠快速識(shí)別血型，并對(duì)包括貧血和真性紅細(xì)胞增多癥在內(nèi)的不同血液疾病進(jìn)行快速篩查，且每次需要血液樣本僅為1μL。該芯片的基本原理和檢測(cè)流程[3]如圖4所示。

圖4 微流控血液檢測(cè)芯片基本原理和檢測(cè)流程[3]

吳凡等[32]設(shè)計(jì)了微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，該系統(tǒng)適用于Duffy血型基因分型篩選，可用于建立稀有血型庫(kù)，解決稀有血型患者緊急輸血問(wèn)題，提高輸血安全性。該系統(tǒng)的快捷篩選、分析Duffy血型基因型方法對(duì)于建立稀有血型獻(xiàn)血者信息檔案具有重要意義。

3.2 腫瘤細(xì)胞快速篩查

陳薇等[33]設(shè)計(jì)了一種基于細(xì)胞大小差異的楔形結(jié)構(gòu)微流控芯片，實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）快速分選和富集，并進(jìn)行了臨床驗(yàn)證，結(jié)果表明楔形結(jié)構(gòu)的微流控芯片基本實(shí)現(xiàn)了對(duì)外周血CTCs的捕獲和鑒定，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。Schütt等[34]設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)阻抗檢測(cè)和活細(xì)胞亞群分類(lèi)的超緊湊型納米細(xì)胞測(cè)試芯片，其基本原理如圖5所示。該芯片結(jié)合基于機(jī)器學(xué)習(xí)的算法，生成了特定的數(shù)據(jù)模式以區(qū)分健康的供體和白血病患者，能夠大大改善傳統(tǒng)診斷方法的總成本和時(shí)間。

圖5 白血病微流控芯片原理圖[34]

呂松偉等[35]通過(guò)將明膠-金納米棒復(fù)合的光熱釋放體系與微流控技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了基于微米柱芯片的細(xì)胞捕獲與光熱定點(diǎn)釋放裝置。通過(guò)優(yōu)化捕獲條件，該裝置可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)90%的捕獲效率。由于明膠的溫敏特性和金納米棒的光熱性能，該裝置可以實(shí)現(xiàn)生理溫度37℃下細(xì)胞群體釋放和近紅外光照選擇性釋放，2種釋放方式的釋放效率和細(xì)胞活力均在90%以上。該裝置的全血樣本檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了CTCs的高效捕獲與無(wú)損選擇性釋放。

3.3 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸快速檢測(cè)

危害全球人類(lèi)生命健康的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）屬乙類(lèi)傳染病，是由SARS-CoV-2引起的，主要通過(guò)呼吸道飛沫傳播[36-37]。準(zhǔn)確診斷COVID-19患病個(gè)體并及時(shí)進(jìn)行隔離十分重要，目前核酸檢測(cè)方法主要采用開(kāi)放式熒光定量PCR（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法，但該方法存在一定的局限性，如假陰性率高、人工手動(dòng)操作煩瑣、存在氣溶膠污染和泄漏風(fēng)險(xiǎn)等。張浩等[38]介紹了幾種當(dāng)前我國(guó)應(yīng)用于COVID-19檢測(cè)的基于微流控芯片技術(shù)的高通量即時(shí)檢驗(yàn)（point-of-care testing，POCT）產(chǎn)品，其原理是采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)樣本中裂解后的RNA，檢測(cè)時(shí)間為30～80 min，檢測(cè)通量為1～80個(gè)樣本，配套試劑病毒拷貝數(shù)檢出限為250～330 copies/mL。

杭躍航等[39]設(shè)計(jì)了一種基于磁珠法的兩相流液滴微流控芯片（其基本原理如圖6所示），建立了磁珠和液滴在兩相流體系內(nèi)的動(dòng)力學(xué)模型，并借助有限元仿真平臺(tái)對(duì)磁珠微團(tuán)所處環(huán)境進(jìn)行了磁場(chǎng)仿真，得到不同體積磁珠微團(tuán)所受的磁力，并進(jìn)一步分析了磁珠微團(tuán)、液滴體積、永磁體移動(dòng)速度對(duì)液滴運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響，最終總結(jié)出液滴操縱圖。該芯片包含了樣品提純、擴(kuò)增和檢測(cè)一系列連續(xù)的生化過(guò)程，可用于核酸快速檢測(cè)。

3.4 其他領(lǐng)域應(yīng)用研究現(xiàn)狀

微流控芯片在快速檢測(cè)血液中有害細(xì)菌[40-41]、血液凝血特性測(cè)試[42]、全血細(xì)胞中白細(xì)胞分離[43]、HIV快速檢測(cè)[44-46]等領(lǐng)域也有豐富的研究成果，部分已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，有望實(shí)現(xiàn)后續(xù)大規(guī)模的臨床應(yīng)用。

圖6 兩相流液滴微流控芯片原理圖[39]

Faridi等[40]提出了基于慣性微流控技術(shù)從全血中分離細(xì)菌的方法，通過(guò)加入顆粒優(yōu)化了流動(dòng)條件，并實(shí)現(xiàn)了5μm顆粒與2μm顆粒的連續(xù)分離，試驗(yàn)結(jié)果表明從未稀釋的全血樣本中連續(xù)分離細(xì)菌的效率可以達(dá)到76%。Mena等[42]設(shè)計(jì)了用于測(cè)量凝血的連續(xù)微流體黏度計(jì)，其工作原理是使血液流入微流道中，在設(shè)定壓力下，液滴的長(zhǎng)度與所輸送的血液樣本的黏度成反比。Phillips等[46]設(shè)計(jì)了一種低成本、便攜式HIV檢測(cè)平臺(tái)microRAAD（如圖7所示），可以自動(dòng)檢測(cè)全血中HIV的RNA，即使在室溫下放置3周后，該平臺(tái)也會(huì)自動(dòng)從全血中分離出HIV-1 RNA，并能夠?qū)ζ溥M(jìn)行擴(kuò)增。

4 結(jié)語(yǔ)

微流控檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展有效促進(jìn)了現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)檢測(cè)和精準(zhǔn)、個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展，大大降低了醫(yī)學(xué)檢測(cè)對(duì)設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員素質(zhì)的依賴(lài)。但當(dāng)前微流控技術(shù)還不夠完善，在檢測(cè)精度、應(yīng)用領(lǐng)域以及成本控制等方面還有很大的局限性，為了使微流控芯片技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域乃至基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的做用，亟須解決以下幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題：

（1）簡(jiǎn)化樣本處理過(guò)程，降低檢測(cè)人員專(zhuān)業(yè)技術(shù)需求。當(dāng)涉及實(shí)驗(yàn)步驟多、人工操作煩瑣時(shí)，可能會(huì)因?yàn)槿藶椴僮髌钣绊憴z測(cè)精度。因此，微流控芯片封裝應(yīng)力求功能集成化，盡量簡(jiǎn)化人為操作環(huán)節(jié)。

（2）提升檢測(cè)通量或提高多項(xiàng)目檢測(cè)集成程度。根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景提供不同的技術(shù)方案，如針對(duì)醫(yī)院提供高通量檢測(cè)滿足大批量檢測(cè)，針對(duì)個(gè)人實(shí)現(xiàn)多檢測(cè)項(xiàng)目的集成。

（3）提升檢測(cè)精度和檢測(cè)效率。應(yīng)在試劑響應(yīng)速度和精度、檢查項(xiàng)目集成化等方面尋求新的技術(shù)突破，在避免誤診的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)高效檢測(cè)。

（4）開(kāi)展廣泛臨床驗(yàn)證，并建立醫(yī)患、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)認(rèn)可機(jī)制，使醫(yī)院和檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)能夠認(rèn)可個(gè)人檢測(cè)數(shù)據(jù)，從而避免重復(fù)檢測(cè)，縮短后續(xù)就診時(shí)間。

圖7 microRAAD實(shí)物圖[46]

微流控芯片技術(shù)的最大產(chǎn)業(yè)化場(chǎng)景是體外診斷，隨著互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療概念的提出和部署，智能化醫(yī)療檢測(cè)終端，特別是即時(shí)診斷設(shè)備具有廣闊的市場(chǎng)空間。在此背景下，基于微流控芯片技術(shù)的檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)工作流程的自動(dòng)化，同時(shí)更能確保品質(zhì)和生產(chǎn)的一致性，很好地滿足互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療發(fā)展對(duì)智能化醫(yī)療檢測(cè)終端的需求。微流控芯片檢驗(yàn)技術(shù)離大規(guī)模臨床應(yīng)用還需要一段時(shí)間，相信隨著新材料、新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，基于微流控的血液檢測(cè)技術(shù)必將不斷完善，為實(shí)現(xiàn)高通量、低成本、高精度、實(shí)時(shí)性的血液檢測(cè)提供新的技術(shù)方案。