馬延琴，徐曉裕，李 甜，李春燕，蔣 霞，王 斌，史學偉*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

葡萄表皮具有非常豐富的微生物資源，包括酵母、霉菌和細菌[1]。葡萄表皮的酵母包括參與酒精發(fā)酵的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和對葡萄酒風味具有重要貢獻的非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），受葡萄園氣候、環(huán)境和葡萄品種影響較大，表現(xiàn)出明顯的地域特色[2]。非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中分泌各種胞外酶（如β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶），將葡萄汁中的糖分、含氮化合物和含硫化物轉(zhuǎn)化為風味物質(zhì)，賦予葡萄豐富的水果香和花香類香氣[3-5]。

在釀造過程中，葡萄酒酒體香氣因葡萄酒揮發(fā)性成分、含量及平衡關系變化而發(fā)生改變[6]。葡萄中的揮發(fā)性物質(zhì)大多以結(jié)合態(tài)的形式存在，非釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種酶類可以降解大分子化合物，將結(jié)合態(tài)的揮發(fā)性風味物質(zhì)釋放出來，提高葡萄酒香氣的復雜性[7]。β-葡萄糖苷酶通過酶促水解移除相應的糖配基進而斷裂糖苷鍵后釋放揮發(fā)性香氣成分[8]。蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，為葡萄酒酸類和醇類等香氣物質(zhì)的形成提供重要的前體[9]。脂肪酶能夠逐漸將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，進而產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)[10]。

非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中對葡萄酒風味形成具有重要作用，然而能用于改善葡萄酒風味的非釀酒酵母制劑很少。本研究以新疆釀酒葡萄為原料，分離和鑒定產(chǎn)酶非釀酒酵母，并對非釀酒酵母的酶學特性進行分析，為產(chǎn)酶非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵中的應用提供理論依據(jù)，為后續(xù)葡萄酒增香及開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

赤霞珠葡萄：采摘于新疆瑪納斯葡萄園區(qū)，利用五點取樣法在不同種植區(qū)域中采取不同品種的葡萄樣品。采集過程中，將采集樣品放入無菌自封袋中貼上標簽。葡萄樣品保存在4 ℃條件下，并于24 h內(nèi)運回實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

坎迪達尼克森選擇性瓊脂（bismuth sulfite glucose glycine yeast agar，BIGGY）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基[11]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基[12]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基[13]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，NH4NO33 g/L，KH2PO44 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，溫度為60～70 ℃時加入對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrobenzene-β-D-galactopyranoside，p-NPG）1 g/L。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基[14]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，脫脂乳粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

脂肪酶篩選培養(yǎng)基[15]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，甘油三丁酸酯10 mL/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京博邁生物科技有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、Ladder Marker、DNA擴增引物：上海生工生物技術有限公司。所有試劑為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠制造；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司；DYY-8CLHP電泳儀：北京六一生物科技有限公司；GelDOCXR凝膠成像系統(tǒng)：美國BioRad公司；B250恒溫水浴鍋：上海予卓儀器有限公司；X7酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒葡萄表皮微生物的分離和純化

將去梗后并保持完整的葡萄樣品放入無菌三角瓶中，加入100 mL無菌水振蕩混勻（30 ℃、180 r/min振蕩2 h），取1 mL懸浮液按10-1、10-2、10-3、10-4和10-5共5個梯度進行稀釋，各取200 μL涂布于YPD培養(yǎng)基上，30 ℃倒置恒溫培養(yǎng)48 h，劃線分離，直至出現(xiàn)單菌落。酵母以40%甘油保存在-20 ℃冰箱。

1.3.2 酵母菌株的形態(tài)觀察

菌株在YPD固體平板中30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌株的形態(tài)大小進行初步判定是否為酵母菌，并在光學顯微鏡下根據(jù)單細胞的個體大小及酵母菌典型細胞結(jié)構(gòu)進一步判斷菌株的類型，并命名。

1.3.3 酵母菌株分子生物學鑒定

根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以提取真菌的總DNA為模板，采用ITS通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通過PCR擴增序列，反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，52 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將擴增后的酵母菌PCR產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠電泳上跑樣，確認擴增結(jié)果和片段的大小，使用Marker判斷擴增條帶大小。將條帶清楚的PCR產(chǎn)物純化后寄往上海生工生物科技有限公司進行測序。將測序結(jié)果通過基本局部比對搜索工具（basiclocal alignmentsearchtool，BLAST）與美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，用軟件Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶菌株的篩選及酶活性測定

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌的定性：由于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株在以p-NPG為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上能水解p-NPG生成對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP），在Na2CO3作用下可形成黃色光圈。光圈顏色深淺能初步反映酶活性高低。因此，將菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后接種在篩選培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h，噴1 mol/L Na2CO3進行顯色，黃色光圈明顯的菌株即為目標菌株[16]，接種于斜面4 ℃保存，作為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株進行復篩。

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌的定量：將初篩得到的菌株活化后，接種到液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集上清液，即為β-葡萄糖苷酶粗酶液，用于酶活性測定，從中篩選酶活力較高的菌株（以加熱失活的酶液按照同樣處理作為空白）。酶活的測定：離心管中加入0.8 mL上清液和0.2 mL底物溶液（5 mmol/L p-NPG溶解在2 mL pH為5.0的100 mmol/L檸檬酸緩沖溶液，750 μL檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 5.0）和250 μL 1 mmoL/L p-NPG混合）在50 ℃條件下無菌培養(yǎng)25 min后，加入2 mL 1 mol/L碳酸鈉終止反應，在波長400 nm處比色測定酶活，同時用未加酶的0.3 mL的底物溶液作空白對照。酶活定義：在一定溫度和pH條件下，1 min水解產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活單位（U/mL）[17]。

采用加入2%脫脂乳粉于YPD培養(yǎng)基中篩選產(chǎn)蛋白酶活性的菌株。操作方法如下：將分離得到的菌株接種到相應的YEPD培養(yǎng)基，將大小相同的滅菌圓紙片放入液體培養(yǎng)基中于相應的溫度下培養(yǎng)24 h，然后用鑷子取出圓形濾紙片貼到含有2%脫脂乳粉的蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基平板上，置于相應的生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以菌落周圍是否產(chǎn)生白色水解圈為篩選依據(jù)[18]。

蛋白酶活力測定方法：采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定[19]。將具有明顯水解圈的初篩菌株接種于液體培養(yǎng)基后，搖床培養(yǎng)24 h以6 000 r/min離心取上清液，將酪蛋白為底物反應后于波長680 nm處測定吸光度值。酶活定義：1 mL酶液在一定pH值和溫度條件下，每分鐘內(nèi)酪蛋白水解所產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選采用脂肪酶篩選培養(yǎng)基，將含有菌液的濾紙片接種到含有甘油三丁酸酯的培養(yǎng)基中于相應的溫度下培養(yǎng)24 h，待有菌落長出來后將平板放在燈下觀察有無水解圈的產(chǎn)生。有透明水解圈的菌株則為產(chǎn)酶菌株[20]。將具水解圈的菌株接種到液體培養(yǎng)基后離心取上清，用電位及指示劑結(jié)合的滴定法測定酶活[21]。酶活定義：在一定溫度和pH 條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即可定義為1個酶活單位（U/mL）。

1.3.5 菌株耐受性研究

乙醇耐受性實驗[22]：將純化過的酵母菌株以1×106CFU/mL分別接種于含0、4%、8%、12%、16%、20%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600nm值，持續(xù)3 d。

糖耐受性實驗[23]：將純化過的酵母菌株以1×106CFU/mL分別接種于含0、50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、320 g/L葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600nm值，持續(xù)3 d。

二氧化硫耐受性實驗[24]：將純化過的酵母菌株以1×106CFU/mL分別接種于含0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、320 mg/L二氧化硫的YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600nm值，持續(xù)3 d。

H2S產(chǎn)生實驗[25]：將純化過的酵母菌株在坎迪達尼克森選擇性瓊脂（BIGGY）培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，每隔24 h 觀察菌株顏色的變化。顏色分為四類：乳白色（+）、淺棕褐色（++）、棕褐色（+++）、褐色（++++）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實驗過程中每個樣本設置3個平行，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。用Edraw（V7.2.0.2467）畫圖軟件整合并繪制微生物菌株產(chǎn)酶示意圖。SPSS 19.0進行差異顯著性分析，Origin 9.0軟件進行實驗圖的繪制，R軟件（4.0.3）繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離與鑒定

2.1.1 酵母的分離

本研究從新疆昌吉地區(qū)釀酒葡萄表皮篩選得到了62株酵母菌，編號為CZ1～CZ10，AG1～AG9，KL1～KL6，KS1～KS12，PM1～PM16，Y1～Y9。具有代表性的酵母菌落形態(tài)分別見圖1和表1。

圖1 篩選酵母菌細胞形態(tài)及鏡檢結(jié)果Fig. 1 Cell morphology and microscopic examination results of screened yeasts

表1 篩選酵母菌菌落形態(tài)Table 1 Colony morphology of screened yeasts

從圖1、表1可知，通過篩選代表性菌株的單個菌落圖發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌落是圓形。酵母菌株顏色主要為白色、淡粉色。大多數(shù)微生物菌株的表面光滑或有光澤，菌株邊緣整齊且不透明，菌落形狀基本都為高凸起。由鏡檢結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，酵母的形態(tài)有圓形、橢圓形和棱狀，能明顯觀察到部分酵母的細胞核、液泡及細胞壁。

2.1.2 酵母的鑒定

根據(jù)酵母菌株的形態(tài)篩選出12株具有代表特征的酵母菌并命名。按照真菌提取試劑盒說明書提取DNA并進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察其條帶是否明顯，是否符合測序標準，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母菌PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of yeasts

由圖2可知，所有酵母菌的分子大小都在750 bp左右，且條帶非常清晰明亮，沒有明顯拖尾或是特別顯著的現(xiàn)象，PCR擴增產(chǎn)物符合測序標準并送往上海生工進行測序。得到的測序結(jié)果再根據(jù)Mega軟件進行序列的1 000次置信分析即可得到酵母菌的進化樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于26S rDNA序列分析酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA sequence analysis

由圖3可知，菌株KL6、CZ3和KS5為葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌株KS3和PM11為仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）；菌株Y1為德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）；菌株CZ10、AG2、Y8、CZ4和PM13為畢赤克魯維酵母（Pichia kluyveri）；菌株PM14為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

2.2 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶菌株的篩選及酶活測定

以篩選得到的葡萄表皮樣品中的62株酵母菌為研究對象，篩選得到12株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶較高的菌株結(jié)果見表2。

表2 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶酵母菌株的酶活測定Table 2 Enzyme activity determination of yeast strain with high production of β-glucosidase, protease and lipase U/mL

由表2可知，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶活性最高的分別是菌株CZ4（214.57 U/mL）、KS5（178.56 U/mL）和KS3（184.68 U/mL）；而最低的分別是菌株Y1（126.24 U/mL）、KL6（60.19 U/mL）和KL6（55.04 U/mL）?？梢钥闯?，菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活性明顯高于蛋白酶和脂肪酶活性。

2.3 酵母酶學特性分析

2.3.1 菌株耐受性分析

根據(jù)以上產(chǎn)酶菌株篩選得到的3株優(yōu)良產(chǎn)酶酵母菌株（KS3、CZ4、KS5），對其進行耐受性分析，結(jié)果見表3。

表3 酵母菌株耐受性Table 3 Tolerance of yeast strains

由表3可知，隨著SO2濃度逐漸增加時，菌株KS5的SO2耐受性呈先增加后減少的趨勢，SO2含量為350 mg/L時，生長受到抑制，但仍能緩慢生長；當糖含量逐漸增加時，菌株整體耐受性先增加后減少，在糖含量為200 g/L的環(huán)境中能夠生長，而在250 g/L環(huán)境生長受到抑制；隨著酒精含量的增加，酒精耐受性逐漸減弱，在酒精含量為16%時，雖然生長受到抑制但仍能生長，在酒精含量為20%時，生長受到強烈抑制。菌株KS3隨著SO2含量的增加，生長量呈先增加后減少的趨勢，SO2耐受量達到300 mg/L，但當SO2含量為350 mg/L時，生長受到抑制；隨著糖含量的增加，其糖耐受性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；隨著酒精含量的上升，菌株KS3的生長量呈先升高后降低的趨勢，酒精含量為20%時，其生長受到了抑制。隨著SO2濃度的增加，菌株CZ4的生長量先增加后降低，在100 mg/L的環(huán)境中生長且生長量提升，但在350 mg/L時，生長受到抑制；隨著糖含量的增加，生長量呈先增加后減少的趨勢，在糖含量為200 g/L的環(huán)境中能夠生長，而在250 g/L環(huán)境生長受到抑制；隨著酒精含量的上升，生長量同樣呈先增加后減少的趨勢，當酒精含量為20%時，生長受到了抑制。

2.3.2 H2S的產(chǎn)生

選擇產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶活性最高的菌株CZ4、KS5和KS3在Biggy瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察酵母菌株菌落的顯色情況判斷H2S產(chǎn)生情況，結(jié)果見表4。

表4 酵母菌H2S產(chǎn)生試驗結(jié)果Table 4 H2S production test results of strain

酵母菌株H2S產(chǎn)生量根據(jù)菌株在BIGGY培養(yǎng)基中顏色深淺判斷。由表4可知，菌株CZ4、KS3、KS5的H2S產(chǎn)生量均較低，適用于釀造葡萄酒。

3 結(jié)論

通過對所選釀酒葡萄表皮酵母菌的分離鑒定，從葡萄表皮篩選到62株酵母菌。通過對所篩酵母菌株的產(chǎn)酶特性分析，其中3株酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶活最高，分別是Pichia kluyveriCZ4（214.57 U/mL）、Hanseniaspora uvarumKS5（178.56 U/mL）和Hanseniaspora opuntiaeKS3（184.68 U/mL）。為了確保酵母菌株能夠在葡萄酒釀造環(huán)境中正常生長并提高葡萄酒品質(zhì)，對選取的產(chǎn)3種酶活性較高的酵母菌株進行了耐受性和H2S產(chǎn)生量分析，結(jié)果表明，三株菌的SO2耐受性、糖耐受性和酒精耐受性整體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，H2S產(chǎn)生量較低，能夠耐受葡萄酒釀造的環(huán)境。葡萄酒香氣大多數(shù)以結(jié)合態(tài)的形式存在，而通過酵母菌株自身代謝的酶類可以將結(jié)合態(tài)香氣轉(zhuǎn)化為游離態(tài)香氣，促進葡萄酒香氣的呈現(xiàn)，提高葡萄酒品質(zhì)。通過對產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶酵母菌株的篩選，確定產(chǎn)酶效果較好的酵母菌株，為后續(xù)葡萄酒釀造增香效應研究提供理論基礎。