欒 浩，周劍麗，2，屈 午，鄧 丹，羅配琴，邱樹毅，余曉斌*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550007；3.貴州茅臺（集團(tuán)）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州 丹寨 557500；4.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003）

藍(lán)莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木植物[1]，含有極其豐富的天然水溶性色素花色苷[2]。藍(lán)莓不僅可以鮮食，還可以被加工成飲料、果干、果脯、果酒等，生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的果渣，然而果渣中的花色苷含量很高[3]。花色苷是一種很好的功能性保健物質(zhì)，具有預(yù)防心臟病、抗氧化活性、清除自由基、延緩衰老、抑制癌細(xì)胞和抑菌等活性[4-8]。

溶劑法提取藍(lán)莓果渣中花色苷含有糖類、蛋白質(zhì)、淀粉、有機(jī)酸和脂肪等雜質(zhì)，粗提物保存時間短、純度低[9]，需要對粗提物進(jìn)一步的純化。大孔樹脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂[10]，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低、操作簡單和效率高等優(yōu)點。因此，本實驗選用D101型大孔樹脂和AB-8型大孔樹脂對藍(lán)莓果渣進(jìn)行分離純化，考察了靜態(tài)試驗中吸附時間，樣液pH、解吸時間、解吸液pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)等和動態(tài)試驗中上樣濃度、上樣流速和洗脫流速等對藍(lán)莓果渣花色苷分離純化效果的影響，從而確定大孔樹脂分離純化藍(lán)莓果渣花色苷的最優(yōu)工藝條件，為藍(lán)莓果渣花色苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果渣：由貴州茅臺（集團(tuán)）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司提供，經(jīng)解凍、干燥，粉碎過60目篩處理；D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂：無錫特達(dá)生物公司；無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、鹽酸、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚、酒石酸鉀鈉四水合物等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計：梅特勒-托利多國際股份有限公司；U-3900紫外可見光分光光度計：日本日立株式會社；CP2102電子天平：奧豪斯儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA：上海亞榮生化儀器廠；BSZ-100自動部分收集器：上海金鵬分析儀器有限公司；synergy H4酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；J-20×PI超高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher Scientific公司；Agilent-1260高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫公司

1.3 試驗方法

1.3.1 藍(lán)莓果渣花色苷粗提液的制備[11]

藍(lán)莓果渣用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇（鹽酸調(diào)pH至3）溶解，以料液比1∶15（g/mL）進(jìn)行提取，放在磁力攪拌器上1000r/min攪拌30 min，然后4 000×g離心10 min，取上清抽濾，45 ℃、100 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得到藍(lán)莓果渣花色苷粗提濃縮液。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

將兩種大孔樹脂分別放入燒杯中，加入無水乙醇沒過大孔樹脂浸泡24 h，使其充分溶脹。將大孔樹脂濕法裝柱，用蒸餾水沖洗至流出液澄清、無白色渾濁，繼續(xù)用蒸餾水沖洗至流出液無醇味；將沖洗好的大孔樹脂倒入燒杯，加入體積分?jǐn)?shù)4%的鹽酸溶液浸泡4 h，裝柱用水沖洗至中性；再加入50 g/L氫氧化鈉浸泡4 h，裝柱用水沖洗至中性；處理好的樹脂加水浸泡，備用[12]。

1.3.3 大孔樹脂的篩選

分別準(zhǔn)確稱取2 g大孔樹脂AB-8和D101于錐形瓶中，向其中加入50 mL稀釋后的藍(lán)莓果渣花色苷提取液，波長520 nm處測定其吸光度值A(chǔ)0，30 ℃條件下振蕩吸附24 h，待樹脂吸附完全后，過濾，測定其吸光度值A(chǔ)1，計算吸附率[13]；向吸附完全的大孔樹脂中加入50 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液（pH3），30 ℃條件下振蕩解吸24 h，過濾，測定其吸光度值A(chǔ)2，計算解吸率[13]。吸附率、解吸率計算公式如下：

1.3.4 大孔樹脂純化條件研究

（1）靜態(tài)吸附和解吸實驗

靜態(tài)吸附平衡時間的測定：準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的2 g大孔樹脂AB-8于錐形瓶中，然后加入50 mL一定質(zhì)量濃度的藍(lán)莓果渣花色苷提取液，在30 ℃條件下振蕩吸附，每隔30 min取1 mL上清液于波長520 nm處測定其吸光度值，繪制靜態(tài)吸附曲線。

靜態(tài)解吸平衡時間的測定：準(zhǔn)確稱取吸附飽和的2 g大孔樹脂AB-8于錐形瓶中，然后加入50 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液（pH3），在30 ℃條件下振蕩解吸，每隔30 min取1 mL上清液于波長520 nm處測定其吸光度值，繪制靜態(tài)解吸曲線。

藍(lán)莓果渣花色苷提取液pH值對大孔樹脂吸附率的影響：用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液分別配制pH為1、2、3、4、5的藍(lán)莓果渣花色苷提取液，然后分別取50 mL加入盛有2 g大孔樹脂AB-8的錐形瓶中，將錐形瓶放在30 ℃條件下振蕩吸附6 h，分別取1 mL上清液于波長520 nm處測定其吸光度值，計算吸附率。

解吸液的pH值對大孔樹脂解吸率的影響：用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液分別配制pH為1、2、3、4、5的體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，然后分別取50 mL加入盛有2 g大孔樹脂AB-8的錐形瓶中，將錐形瓶放在30 ℃條件下振蕩解吸6 h，分別取1 mL上清液于波長520 nm處測定其吸光度值，計算解吸率。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂解吸率的影響：準(zhǔn)確稱取吸附飽和的2 g大孔樹脂AB-8于錐形瓶中，向其中分別加入50 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（pH3），在30 ℃條件下振蕩解吸6 h，分別取樣1 mL上清液于波長520 nm處測定其吸光度值，計算解吸率。

（2）動態(tài)吸附和解吸實驗

上樣濃度對大孔樹脂吸附率的影響：稱取預(yù)處理過的10 g大孔樹脂AB-8，濕法裝入層析柱中，分別加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL的花色苷提取液（pH3），測定初始吸光度值A(chǔ)0。將不同濃度的花色苷提取液以1.0 mL/min的流速流過樹脂，測定流出液的吸光度值A(chǔ)1，計算吸附率。

上樣流速對大孔樹脂吸附率的影響：稱取預(yù)處理過的10 g大孔樹脂AB-8，濕法裝入層析柱中，取1 mg/mL的花色苷提取液（pH3），測定初始吸光度值A(chǔ)0。分別以0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、3.0 mL/min流速流過樹脂，測定流出溶液的吸光度值A(chǔ)1，計算吸附率。

泄露曲線的測定：稱取預(yù)處理過的10 g大孔樹脂AB-8，濕法裝入層析柱中，加入1 mg/mL的花色苷提取液（pH3）200 mL，以1 mL/min流過樹脂，每10 mL收集一次流出液測定吸光度值，當(dāng)流出液吸光度值達(dá)到上樣溶液的1/10時認(rèn)為花色苷溶液開始透出[14]，停止上樣，繪制泄露曲線。

洗脫流速對大孔樹脂解吸率的影響：稱取預(yù)處理過的10 g大孔樹脂AB-8，濕法裝入層析柱中，加入1 mg/mL的花色苷提取液（pH3），以1 mL/min流過樹脂，使樹脂吸附飽和。吸附飽和后的樹脂用蒸餾水清洗[15]，然后加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液（pH3），以0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、3.0 mL/min流速流過樹脂進(jìn)行解吸，測定流出液的吸光度值，計算解吸率。

解吸曲線的測定：稱取預(yù)處理過的10 g大孔樹脂AB-8，濕法裝入層析柱中，加入1 mg/mL花色苷提取液（pH3），以1 mL/min流過樹脂，使樹脂吸附飽和。吸附飽和后的樹脂用蒸餾水清洗殘留的雜質(zhì)，然后加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液（pH3）200 mL，以1 mL/min流過樹脂進(jìn)行解吸，每5 mL收集一次流出液測定吸光度值，繪制解吸曲線。

1.3.5 分析檢測

（1）色價的測定

根據(jù)國標(biāo)GB 25536—2010《食品添加劑蘿卜紅》[16]略作改動測定花色苷的色價。稱取0.5 g試樣（精確至0.000 1 g），用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH3）溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH3）定容至刻度，搖勻，取樣品溶液于1 cm比色皿中在波長520 nm處測定吸光度值并計算色價，其計算公式如下：

式中：A為試樣溶液的吸光度值；c為被測樣品溶液質(zhì)量濃度（g/mL）；100為質(zhì)量濃度換算系數(shù)（對應(yīng)色價規(guī)定換算成試樣質(zhì)量濃度為1 g/100 mL）。

（2）花色苷的測定

樣品處理：分別稱取純化前后花色苷凍干粉1 mg溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，過0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行HPLC檢測。檢測條件[17]：Agilent 20RBAX-SB C18液相柱（4.6 mm×150 mm×5 μm），檢測波長520 nm，流速0.9 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫25 ℃。流動相A為甲醇，流動相B為3%甲酸溶液。梯度洗脫程序如下：0～15 min，5%→25%A；15～25 min，25%→32%A；25～35 min，32%→60%A；35～45 min，60%→80%A；45～55 min，80%→100%A。根據(jù)樣品的出峰時間定性，并計算峰面積。

（3）糖和蛋白質(zhì)含量的測定

可溶性糖含量的測定[18-19]：采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS）測定；蛋白質(zhì)含量的測定[20]：考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0進(jìn)行處理，實驗重復(fù)測定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

花色苷含有較多酚羥基和糖苷鏈，有一定的極性和親水性，易被極性和弱極性的樹脂吸附，同時樹脂的吸附能力在平均孔徑相差不大的情況下，比表面積越大吸附能力越強(qiáng)[21-22]。由表1可知，AB-8型大孔樹脂吸附率和解吸率分別為88.5%、64.7%，稍優(yōu)于D101型大孔樹脂。所以選取AB-8型大孔樹脂進(jìn)行下一步研究。

表1 不同大孔樹脂的吸附率和解吸率Table 1 Adsorption and desorption rates of different macroporous resins

2.2 靜態(tài)吸附和解吸實驗

2.2.1 吸附平衡時間的確定

由圖1可知，AB-8型大孔樹脂對藍(lán)莓果渣花色苷粗提取液的吸附率隨時間延長迅速增加，在4h時吸附率基本達(dá)到最大，吸附時間繼續(xù)延長，大孔樹脂對藍(lán)莓果渣提取液的吸附基本飽和，處于動態(tài)平衡。所以，靜態(tài)吸附的飽和時間為4 h。

圖1 藍(lán)莓果渣花色苷靜態(tài)吸附平衡曲線Fig. 1 Static adsorption equilibrium curve of anthocyanins from blueberry pomace

2.2.2 解吸平衡時間的確定

由圖2可知，AB-8型大孔樹脂對藍(lán)莓果渣花色苷提取液的解吸率隨時間延長迅速增加，在4 h時解吸率基本達(dá)到最大（59%），隨著時間的延長，解吸率維持動態(tài)平衡，基本穩(wěn)定。在4 h和6 h的解吸率相差不大。所以，靜態(tài)解吸的時間為4 h。

圖2 藍(lán)莓果渣花色苷靜態(tài)解吸平衡曲線Fig. 2 Static desorption equilibrium curve of anthocyanins from blueberry pomace

2.2.3 藍(lán)莓果渣花色苷提取液pH值對大孔樹脂吸附率的影響

由圖3可知，大孔樹脂的吸附率隨著藍(lán)莓果渣花色苷提取液pH的升高而降低，這可能是因為花色苷在不同pH下存在的4種結(jié)構(gòu)形式比例不相同所導(dǎo)致的[23]。在pH1、pH2和pH3時花色苷提取液吸附率相差不大，而pH1和pH2時花色苷的糖基容易水解，造成花色苷穩(wěn)定性降低[24]。當(dāng)pH為3時，樣品吸附率為83.6%。所以，選擇花色苷提取液pH為3。

圖3 藍(lán)莓果渣花色苷提取液pH對大孔樹脂吸附率的影響Fig. 3 Effects of pH of anthocyanins extracts from blueberry pomace on the adsorption rate of macroporous resin

2.2.4 解吸液的pH值對大孔樹脂解吸率的影響

由圖4可知，解吸液的pH值對花色苷溶液的解吸影響較大，隨著pH的升高，花色苷的解吸率降低。pH1、pH2和pH3時，花色苷提取液解吸率差異不顯著（P＞0.05），而pH1和pH2時，花色苷的糖基容易水解，造成花色苷穩(wěn)定性降低[24]。所以，選擇解吸液pH為3。

圖4 解吸液pH對大孔樹脂解吸率的影響Fig. 4 Effects of pH of desorption solution on desorption rate of macroporous resin

2.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂解吸率的影響

由圖5可知，大孔樹脂對花色苷提取液的解吸能力隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解吸率先增加后減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時解吸率最高（72.6%）。如果乙醇體積分?jǐn)?shù)≤60%，樹脂中的花色苷則不能被完全洗脫出來；如果乙醇體積分?jǐn)?shù)＞60%，不僅造成浪費而且會有更多的雜質(zhì)被洗脫下來，影響花色苷的純度[25-26]。所以，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔樹脂解吸率的影響Fig. 5 Effects of ethanol volume fraction on desorption rate of macroporous resin

2.3 動態(tài)吸附和解吸實驗

2.3.1 上樣質(zhì)量濃度對大孔樹脂吸附率的影響

由圖6可知，隨著花色苷濃度的增大，AB-8型大孔樹脂的吸附率先增加后減小，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，吸附率達(dá)到最大（82.3%）。當(dāng)花色苷濃度較低時，大孔樹脂吸附時間增加，從而降低純化效率；而花色苷濃度過高時，會增加雜質(zhì)的吸附率，導(dǎo)致樣液過早泄露，降低大孔樹脂的吸附效果。所以，選擇最佳上樣質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

圖6 上樣質(zhì)量濃度對大孔樹脂吸附率的影響Fig. 6 Effects of loading mass concentration on adsorption rate of macroporous resin

2.3.2 上樣流速對大孔樹脂吸附率的影響由圖7可知，隨著上樣流速的增大，花色苷的吸附率先增加后減小，在上樣流速為1 mL/min時，花色苷的吸附率

圖7 上樣流速對大孔樹脂吸附率的影響Fig.7 Effects of loading flow rate on adsorption rate of macroporous resin

達(dá)到最大（83%）。當(dāng)上樣流速過快時，縮短了花色苷溶液與大孔樹脂表面的接觸時間，不能充分的進(jìn)行吸附；上樣流速過慢時，增加了吸附時間，降低吸附效率[21]。所以，選擇最佳上樣流速為1 mL/min。

2.3.3 泄露曲線的測定

由圖8可知，初始流出液中不含花色苷，隨著上樣體積的不斷增加，吸光度值也不斷增大，大孔樹脂慢慢吸附飽和，流出液中花色苷含量增加。一般認(rèn)為當(dāng)流出液的吸光度值達(dá)到或超過上樣溶液吸光度值的1/10時，即認(rèn)為大孔樹脂吸附飽和，發(fā)生泄露。藍(lán)莓果渣提取液吸光度值為3.80，當(dāng)藍(lán)莓果渣提取液上樣體積達(dá)到140 mL時，流出液的吸光度值為0.38，流出液的吸光度值達(dá)到了上樣溶液吸光度值的1/10，上樣體積應(yīng)不超過140 mL為宜。

圖8 吸附泄露曲線Fig. 8 Adsorption leakage curve

2.3.4 洗脫流速對大孔樹脂解吸率的影響

由圖9可知，隨著洗脫流速的增加，花色苷的解吸率減少。洗脫流速越快，解吸液與大孔樹脂接觸的時間越短，不能充分的洗脫下來，解吸效果不好；在低流速時，解吸液與大孔樹脂充分接觸，使花色苷從樹脂中洗脫出來，所以解吸率比較高[21]。在0.5 mL/min和1.0 mL/min流速下，解吸率變化不明顯。所以，選擇最佳洗脫流速為1.0 mL/min。

圖9 洗脫流速對大孔樹脂解吸率的影響Fig. 9 Effect of elution flow rate on desorption rate of macroporous resin

2.3.5 解吸曲線的測定

由圖10可知，隨著解吸液體積的不斷增加，流出液吸光度值迅速升高然后慢慢降低。當(dāng)解吸液體積達(dá)到5 mL時，流出液吸光度值慢慢增大，花色苷開始逐漸從樹脂中洗脫下來；當(dāng)解吸液體積達(dá)到10 mL時，達(dá)到洗脫高峰，繼續(xù)增加解吸液體積，流出液吸光度值逐漸降低，流出液中花色苷含量降低。解吸液體積60 mL時，流出液中幾乎不含花色苷。所以，選擇解吸液體積為60 mL。

圖10 藍(lán)莓果渣花色苷提取液動態(tài)解吸曲線Fig.10 Dynamic desorption curve of anthocyanins from blueberry pomace

2.4 純化前后色價比較

經(jīng)過大孔樹脂純化后的藍(lán)莓果渣花色苷色價為31.18，約為原藍(lán)莓果渣花色苷色價（10.5）的3倍；溶液顏色由純化前的紅色變成純化后的紫黑色；凍干后的粉末由最初的粘稠狀黑色固體變成了純化后的紫黑色粉末。說明AB-8型大孔樹脂對藍(lán)莓果渣花色苷純化效果明顯。

2.5 HPLC分析純化前后藍(lán)莓果渣花色苷提取物

由圖11及表3可知，相同干質(zhì)量的純化前和純化后的藍(lán)莓果渣花色苷粉末相比，純化前后藍(lán)莓果渣花色苷都檢測出13個峰，與孫倩怡等[27]利用HPLC檢測出純化前后藍(lán)莓花青素有13個峰的研究結(jié)果一致。純化后花色苷樣品中代表不同花色苷的各個峰的峰面積較純化前有大幅增加，約為純化前的3倍，而總峰面積為純化前的3.15倍。說明經(jīng)大孔樹脂純化后花色苷的純度有較大的提升。

圖11 純化前（a）、后（b）藍(lán)莓果渣花色苷HPLC圖Fig. 11 HPLC chromatogram of anthocyanins from blueberry pomace before (a) and after (b) purification

表3 藍(lán)莓果渣花色苷HPLC圖分析結(jié)果Table 3 HPLC chromatogram analysis results of anthocyanins from blueberry pomace

2.6 大孔樹脂純化前后糖和蛋白含量的測定

藍(lán)莓果渣經(jīng)酸化乙醇提取后，提取液中不僅有花色苷，還有一些糖類和蛋白質(zhì)等也被提取出來，這些物質(zhì)影響花色苷的進(jìn)一步利用[15]。經(jīng)過大孔樹脂純化后，純化前，可溶性糖和蛋白質(zhì)含量分別為0.28 mg/mL、1.66 mg/mL，純化后，可溶性糖和蛋白質(zhì)含量分別為0.19 mg/mL、1.58 mg/mL。這在一定程度上能降低純化后花色苷粉末的吸濕性，利于儲存。

3 結(jié)論

通過對兩種不同類型大孔樹脂的吸附和解吸效果試驗，結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂吸附率和解吸率都優(yōu)于D101型大孔樹脂，該樹脂適用于藍(lán)莓果渣花色苷的分離純化。通過靜態(tài)吸附和解吸試驗確定的最優(yōu)條件：吸附平衡時間4 h，解吸平衡時間4 h，花色苷溶液pH 3.0，解吸液pH 3.0，解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)60%；動態(tài)吸附和解吸試驗確定最優(yōu)條件：上樣質(zhì)量濃度1 mg/mL，上樣流速1 mL/min，洗脫流速1 mL/min。純化后藍(lán)莓果渣花色苷的色價約為純化前的3倍，糖和蛋白質(zhì)含量比純化前都有減少，花色苷冷凍干燥粉末由純化前黑色粘稠狀固體變成純化后紫黑色粉末，純化效果明顯，為藍(lán)莓果渣花色苷后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。