董紅兵，王 菁，龔元元，朱于鵬，3，汪 超，祁勇剛，李蕙蕙*

（1.武漢商學(xué)院食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430056；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；3.恩施硒圣植物科技有限公司，湖北 恩施 445000）

甘藍（Brassica oleraceavar.capitata）又名洋白菜、卷心菜，由于其具有產(chǎn)量高，肉質(zhì)厚而硬、致密堅實的特點，適宜發(fā)酵制備酸菜調(diào)味品或者泡菜。發(fā)酵蔬菜中包括大量的微生物，如細菌、酵母、霉菌等，燕平梅等[1]基于宏基因組學(xué)技術(shù)研究了發(fā)酵甘藍泡菜老湯中的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)泡菜老湯中含有大量的乳酸菌，發(fā)酵后期以耐酸的乳酸菌為主；張銳等[2]研究榨菜腌漬過程中，發(fā)酵初期是明串珠菌，中后期是植物乳桿菌、短乳桿菌；張魯冀等[3]研究自然發(fā)酵的東北酸菜發(fā)現(xiàn)，酸菜中有植物乳桿菌、短乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌；汪冬冬等[4-5]研究發(fā)酵甘藍中細菌變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵甘藍中有植物乳桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌等細菌；曾駿等[6-7]鑒定了發(fā)酵蔬菜中酵母菌有異常漢遜酵母、德式酵母、螺絲酵母、球擬酵母、假絲酵母等；乳酸菌制造酸性環(huán)境利于酵母菌的生長，而酵母菌乙醇代謝產(chǎn)物也有利于乳酸菌的進一步生長，二者具有協(xié)同作用[8-9]。王海平等[10]研究四種腌制方式對甘藍品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)純種濕法可提高發(fā)酵速度和乳酸菌菌落數(shù)，使亞硝峰峰值快速降低至穩(wěn)定值，感官評分也最高；王芮東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，純種發(fā)酵甘藍總酸最高、感官最佳；劉程惠等[12]發(fā)現(xiàn)糖、香辛料和水果的添加可促進甘藍泡菜總酸的增加，糖對亞硝酸鹽有促進作用，而香辛料和水果的添加可抑制其產(chǎn)生；張向美玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，菊花溶液含量為1%時，甘藍發(fā)酵成熟時乳酸菌最高，霉菌較少；汪冬冬等[14]研究發(fā)現(xiàn)，甘藍發(fā)酵溫度范圍為10～35 ℃，提高溫度利于產(chǎn)酸，縮短發(fā)酵時間，溫度與乳酸、乙酸含量呈正相關(guān)，與檸檬酸、蘋果酸和游離氨基酸成反比，低溫有利于防止酸敗。發(fā)酵甘藍中亞硝酸鹽的研究多集中在發(fā)酵方式、菌種篩選、起始pH值、影響因子添加、變化規(guī)律和累積機理研究等[15-18]。

硒元素具有抗氧化和抗癌作用，可提高免疫力和預(yù)防心血管疾病[19]。微生物可以富集和轉(zhuǎn)化無機硒為有機硒，已成為硒生物轉(zhuǎn)化的研究熱點。本研究選用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和異常漢遜酵母（Hansenula anomala）為發(fā)酵菌株，研究添加亞硒酸鈉對接種發(fā)酵甘藍的影響，旨在為提升發(fā)酵甘藍品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平頭甘藍：由湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。

蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑），氯化鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

植物乳桿菌、異常漢遜酵母：實驗室保藏菌種，篩選自湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司大白菜腌漬池。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4700熒光分光光度計：日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHSJ-6L型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PC-420磁力恒溫攪拌器：美國Corning公司；QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機：無錫輕大食品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵甘藍的制備

參考屠夢婷[20]的方法并做改良，將發(fā)酵壇清洗干凈，用體積分數(shù)75%的酒精擦拭滅菌，將洗凈瀝干切分好的甘藍放入發(fā)酵壇中，加4.5%的白砂糖和4.0%食鹽水浸漬，同時加入亞硒酸鈉（濃度分別設(shè)置為0、15 μmol/L、30 μmol/L、45 μmol/L、60 μmol/L、75 μmol/L、90 μmol/L），攪拌均勻，每罐分別加入體積分數(shù)3.0%植物乳桿菌種子液（1.65×109CFU/mL）和體積分數(shù)2.0%異常漢遜酵母菌種子液（1.13×109CFU/mL），密封28 ℃發(fā)酵6 d，試驗重復(fù)3次。

1.3.2 發(fā)酵甘藍感官評價標(biāo)準(zhǔn)

發(fā)酵甘藍的感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵甘藍的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of the fermented cabbage

續(xù)表

1.3.3 乳酸菌和酵母菌的測定

按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》對發(fā)酵甘藍中乳酸菌進行測定；酵母菌按照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》對發(fā)酵甘藍中酵母菌進行測定。

1.3.4 pH、總酸、總酯、硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定

pH測定采用pH計測定；總酸（以乳酸計）按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定；總酯（以乙酸乙酯計）參考GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志山西老陳醋》測定；硝酸鹽和亞硝酸鹽按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定。

1.3.5 總硒和有機硒的測定

總硒和有機硒按照DBS 42/002—2014《富有機硒食品硒含量要求》中方法測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析運用處理與Origin 9.5和SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同亞硒酸鈉添加量對甘藍發(fā)酵中乳酸菌和酵母菌數(shù)的影響

將從腌漬白菜中篩選的乳酸菌和酵母菌接種于甘藍中發(fā)酵，研究亞硒酸鈉的添加量對發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌的影響，結(jié)果分別見表2和表3。由表2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵1 d后乳酸菌由106數(shù)量級迅速增長至108，而后緩慢增大趨于穩(wěn)定；添加了亞硒酸鈉的實驗組，在相同濃度下，發(fā)酵1 d后，乳酸菌菌落數(shù)顯著增大（P＜0.05），且發(fā)酵4 d后，菌落數(shù)達到峰值后保持穩(wěn)定；相同發(fā)酵時間條件下，隨著亞硒酸鈉濃度增加乳酸菌菌落數(shù)也持續(xù)增大，但增速逐漸放緩，在亞硒酸鈉濃度為60 μmol/L時，其乳酸菌菌落數(shù)增速效果較好，為最適宜添加濃度。

表2 不同亞硒酸鈉添加量對甘藍發(fā)酵中乳酸菌數(shù)的影響Table 2 Effect of different sodium selenite addition on number of lactic acid bacteria during cabbage fermentation

由表3可知，亞硒酸鈉對酵母菌的影響與乳酸菌一致，添加了亞硒酸鈉，隨著發(fā)酵時間的延長，酵母菌菌落數(shù)顯著增加（P＜0.05），在發(fā)酵4 d后趨于穩(wěn)定；相同發(fā)酵時間條件下隨著亞硒酸鈉添加量的增加，酵母菌菌落數(shù)逐漸增加，且在亞硒酸鈉濃度為60 μmol/L后，酵母菌增速放緩，因此選擇亞硒酸鈉濃度為60 μmol/L作為后續(xù)研究的最佳值。發(fā)酵液中的亞硒酸鈉可能會被乳酸菌和酵母菌轉(zhuǎn)化利用，進而提高自身代謝速率和抵抗外界環(huán)境的能力，進而促進其快速增殖。

表3 不同亞硒酸鈉添加量對甘藍發(fā)酵中酵母菌數(shù)的影響Table 3 Effect of different sodium selenite addition on number of yeast during cabbage fermentation

2.2 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍pH和總酸含量的影響

在甘藍發(fā)酵前添加亞硒酸鈉，使發(fā)酵液濃度為60μmol/L，接種體積分數(shù)3.0%植物乳桿菌種子液（1.71×109CFU/mL）和體積分數(shù)2.0%異常漢遜酵母菌種子液（1.08×109CFU/mL），發(fā)酵6 d，測定發(fā)酵液pH和總酸，結(jié)果見圖1。

圖1 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍pH和總酸含量的影響Fig. 1 Effect of sodium selenite on pH and total acid contents of fermented cabbage

從圖1可知，隨著發(fā)酵時間延長，甘藍發(fā)酵液總酸穩(wěn)定升高，相比對照組，發(fā)酵1 d后，實驗組總酸增速更快、含量更高，達到0.943 g/100 g。實驗組和對照組的pH隨發(fā)酵時間的變化趨勢一致，接種發(fā)酵后，pH值顯著降低，發(fā)酵2 d后緩慢減低，但實驗組pH降低的更快，發(fā)酵6 d后pH值由初始的5.91降低為3.21，使發(fā)酵液在更短的發(fā)酵時間內(nèi)pH值更低，這可能會縮短甘藍發(fā)酵時間。添加了亞硒酸鈉，促進乳酸菌和酵母菌快速增殖，會代謝產(chǎn)生更多的乳酸、乙酸，造成總酸含量更高，同時，使甘藍發(fā)酵液具有更低的pH值。

2.3 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍總酯的影響

亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍總酯含量的影響見圖2。由圖2可知，實驗組和對照組在發(fā)酵前2天總酯增長緩慢，2 d后明顯增大，發(fā)酵6 d后分別增至3.493 g/kg和2.502 g/kg，可見添加亞硒酸鈉在發(fā)酵第6天時使發(fā)酵甘藍總酯含量提高39.61%。亞硒酸鈉促進植物乳桿菌和異常漢遜酵母的快速增殖，提高發(fā)酵液總酸含量及其本身耐酸性，代謝更多更高含量的酸和醇類，進而提高總酯的含量。

圖2 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍總酯含量的影響Fig. 2 Effect of sodium selenite on total ester contents of fermented cabbage

2.4 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍總硒和有機硒含量的影響

硒是機體不可或缺的微量元素，有機硒被認為更有利于機體吸收，其存在形式也多種多樣，可由機體代謝產(chǎn)生，乳酸菌和酵母菌均具有較強的富硒和有機硒轉(zhuǎn)化能力。添加60 μmol/L亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍中總硒和有機硒的影響見圖3。由圖3可知，發(fā)酵1 d時，隨著植物乳桿菌和異常漢遜酵母菌的快速增殖，亞硒酸鈉大量轉(zhuǎn)化為有機硒，而在發(fā)酵2 d后又顯著增加，原因可能是此時發(fā)酵甘藍中總酸過高，菌株為了抵抗酸性環(huán)境而利用無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒合成功能物質(zhì)以提高自身抗逆性，其他發(fā)酵時間段有機硒增加緩慢，發(fā)酵6 d后，有機硒為3.80 mg/kg，轉(zhuǎn)化率達80.68%。

圖3 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍中總硒和有機硒含量的影響Fig. 3 Effect of sodium selenite on total selenium and organic selenium contents of fermented cabbage

2.5 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響

甘藍中含有硝酸鹽，尤其是化肥過量的使用，導(dǎo)致甘藍的硝酸鹽含量更高[21-22]，因此在腌制過程中甘藍會生成更多的亞硝酸鹽，相對自然發(fā)酵，接種發(fā)酵可以使亞硝酸鹽含量顯著降低[26]。亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍中硝酸鹽和亞硝酸鹽的影響見圖4。

圖4 亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響Fig. 4 Effect of sodium selenite on nitrate and nitrite contents of fermented cabbage

由圖4可知，隨著發(fā)酵進行，甘藍中的硝酸鹽持續(xù)顯著下降（P＜0.05），直至降低到0.093 g/kg以下，而添加了亞硒酸鈉的甘藍硝酸鹽含量比對照組下降更快，發(fā)酵6 d后降至0.057 g/kg；亞硝酸鹽含量隨發(fā)酵時間先增大后減小，對照組在發(fā)酵4 d時達到峰值，為9.273 mg/kg，而實驗組在提前至發(fā)酵3 d時到峰值，為7.058 mg/kg，且峰值更小，這與谷云等[23]的研究一致，因此添加亞硒酸鈉既可以促進發(fā)酵甘藍中硝酸鹽的快速減少，降低安全隱患，又可以降低亞硝酸鹽峰值，使亞硝峰提前達到，降低發(fā)酵周期[24-25]。

2.6 添加亞硒酸鈉的發(fā)酵甘藍感官評價

發(fā)酵6 d制備的發(fā)酵甘藍感官評價見表4。由表4可知，實驗組和對照組在色澤和組織狀態(tài)上無差異，但實驗組的酯香氣濃郁，感官評分比對照組高7分，因此添加亞硒酸鈉基本不影響甘藍的色澤和組織狀態(tài)，但明顯提升了發(fā)酵甘藍的酯香氣。

表4 發(fā)酵甘藍的感官評價結(jié)果Table 4 Sensory evaluation result of fermented cabbage

3 結(jié)論

通過添加亞硒酸鈉，接種植物乳桿菌和異常漢遜酵母發(fā)酵甘藍，研究了亞硒酸鈉對發(fā)酵過程中植物乳桿菌和異常漢遜酵母菌落數(shù)、pH、總酸、總酯、有機硒和亞硝酸鹽等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，亞硒酸鈉能促進植物乳桿菌和異常漢遜酵母快速增殖，其濃度為60 μmol/L最適宜。添加適宜濃度的亞硒酸鈉，甘藍發(fā)酵液總酸增速快，pH也降低的更快，同時提高了總酯含量；通過植物乳桿菌和異常漢遜酵母的生物轉(zhuǎn)化，有機硒轉(zhuǎn)化率高達80.68%；硝酸鹽快速下降，亞硝峰峰值降低，且提前1 d出現(xiàn)。

對發(fā)酵甘藍進行感官評價，添加亞硒酸鈉對發(fā)酵甘藍的色澤和組織狀態(tài)無影響，但可顯著提升其酯香氣。添加亞硒酸鈉，提高了發(fā)酵甘藍總酸和總酯含量，顯著降低了亞硝酸含量，新增了有機硒，提升了發(fā)酵甘藍感官品質(zhì)和整體質(zhì)量。