陳 杰，魏 勇，王晨豫，陳明杰，解津剛，齊亞銀*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000;2.新疆天澳牧業(yè)有限公司，新疆 奎屯 833200)

在奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中，奶牛乳房炎是當前奶牛生產中比較常見的疾病之一。該疾病是由多種病因引起的一種常見性疾病，直接影響奶牛的產奶質量和品質[1]。

據(jù)報道，在奶牛場中，臨床型乳房炎的發(fā)病率為 2%～8%，隱性乳房炎的發(fā)病率更高，并且難以自愈[2]。根據(jù)炎癥的嚴重程度，奶牛乳房炎大體上可以分為臨床型和隱性型，其中臨床型奶牛乳房炎，視覺上可見明顯的受感染表征[3]，而隱性型乳房炎，雖然在臨床體征上沒有明顯的變化，但其對牛奶質量和產量方面均帶來嚴重的影響，也正因其無明顯的特征，所有很難及時診斷并采用有效措施[4]。

相關研究文獻顯示，與臨床型奶牛乳房炎相比，隱性型乳房炎的發(fā)病率要高 15～40 倍[5]。目前，文獻顯示引起奶牛隱性型乳房炎的常見傳染性致病菌大約 20 多種。在超過 90 %的奶牛隱性乳房炎乳樣中，都可以檢測出大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌，因此，以下內容將針對這 3 種病原菌微生物進行詳細介紹[3]。

目前發(fā)現(xiàn)金黃色平葡萄球菌是誘發(fā)奶牛乳房炎的主要病原菌，很難治愈，且由于抗生素的使用產生的耐藥菌株已經普遍存在，因此常常使用疫苗進行防治，對于患牛采用淘汰的方式處理[6]。研究表明，金黃色葡萄球菌主要與生奶中體細胞數(shù)異常升高相關[7]，嚴重影響牛奶品質。

大腸桿菌誘發(fā)的奶牛乳房炎往往多見于泌乳高峰期，常常呈現(xiàn)出急性經過[8]，研究表明，控制大腸桿菌性乳房炎，可有效提高奶牛產奶量[9]，可見大腸桿菌在乳房炎誘發(fā)因素中的地位不容忽略。

只有當奶牛自身發(fā)生變化，如缺乏影響、外傷、擠奶方式不正確或免疫力降低時，鏈球菌才會以乳房炎誘發(fā)因素發(fā)揮作用[10]。單純由鏈球菌誘發(fā)的奶牛隱性型乳房炎，奶牛乳腺表現(xiàn)出的紅腫等炎癥表征不是十分明顯，但產奶量會急劇下降[11]。

當奶牛場出現(xiàn)乳房炎時，繼而會引起一系列糟糕的連鎖反應如牛奶品質的下降、不合格奶牛的淘汰率升高、治療所用藥物成本的增加、牛奶中藥物殘留的增多。這些影響都會極大的降低奶牛場的效益。因此對奶牛場致乳房炎的主要病原菌的分離鑒定，以及提供合理的預防、治療方案是相當重要的[7]。

因此本實驗為查明新疆部分地區(qū)9個規(guī)?；膛瞿膛Ｈ榉垦椎闹虏【滓蝿帐菧蚀_采集還未開展臨床用藥的臨床型乳房炎奶樣和體細胞數(shù)≥50萬個/mL的隱性型乳房炎奶樣，然后結合常規(guī)微生物學實驗室診斷的方法，對新疆部分地區(qū)9個規(guī)?；膛鲋兄氯榉垦字饕≡M行分離鑒定，以及藥敏試驗并給出合理的臨床用藥方案。旨在為奶牛場乳房炎的臨床治療以及預防，提供合理有效的理論指導依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗樣品

試驗樣品采自新疆部分地區(qū)9個規(guī)?；膛?14頭臨床型乳房炎牛只和1 022頭隱性型乳房炎牛只的奶樣，經-4 ℃保存運輸。

1.2 主要試劑及藥品

試驗所需相關試劑見表1。

表1 實驗試劑

1.3 主要儀器與設備

試驗一所需相關儀器與設備見表2。

表2 儀器與設備

2 試驗方法

2.1 樣品采集

2021年5月—6月在新疆部分地區(qū)飼養(yǎng)規(guī)模均為1 000～1 300頭之間的9個規(guī)?；膛?，對均處于泌乳期的成年奶牛進行樣品采集，用5 mL無菌EP管采集，擠奶時選擇已完成前藥浴、棄頭三把奶工作后的奶樣，共采集1 236份奶樣，其中臨床型乳房炎牛只的奶樣共214份，共采取1 022份隱性型乳房炎牛只的奶樣，經-4℃保存運輸。其中隱乳牛只奶樣采集工作，根據(jù)奶牛場的DHI數(shù)據(jù)體細胞數(shù)≥50萬個/mL的泌乳牛只信息，首先通過隱性乳房炎檢測(CMT)法和牛博士體細胞檢測儀的結合應用，判定標準見表3。來準確篩選出奶牛場中隱性型乳房炎牛只的耳號信息，其次再通過奶牛場“阿菲金”軟件系統(tǒng)，在開始每日的擠奶工作時能夠快速、準確的鎖定目標牛只，從而完成隱性型乳房炎奶樣的采集工作。

表3 CMT 判定標準

2.2 致乳房炎主要病原菌菌株的分離純化與保藏

2.2.1 葡萄球菌的分離純化 將奶樣樣品管充分渦旋振蕩均質，移取50 μL轉種于800 μL的LB肉湯培養(yǎng)基內，在37 ℃、180 r/min條件的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。在甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取金黃色單個菌落(且此菌落周圍的甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基的顏色也由最初透明的淡紅色變成了透明的淡黃色)重復轉種于LB肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18～24 h。再次在甘露醇瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取菌落進行涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下鏡檢觀察，將鏡檢呈葡萄串狀，無芽孢、鞭毛，無莢膜的單個菌落再次轉種于腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)18～24 h。

2.2.2 大腸桿菌的分離純化 將奶樣樣品管充分渦旋振蕩均質，移取50 μL，轉種于800 μL的LB肉湯培養(yǎng)基內，在37 ℃、180 r/min條件的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取玫紅色單個菌落重復轉種于LB肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18～24 h。再次在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取菌落進行涂片、革蘭氏染色，于顯微鏡下鏡檢觀察，將鏡檢呈中等大小的革蘭氏陰性桿菌的單個菌落再次轉種于腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)18～24 h。

2.2.3 鏈球菌的分離純化 將奶樣樣品管充分渦旋振蕩均質，移取50 μL，轉種于800 μL的疊氮鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基內，在37 ℃、180 r/min條件的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。在脫纖維綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。 挑取具有溶血環(huán)的菌落重復轉種于疊氮鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18～24 h。再次在脫纖維綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取菌落進行涂片、革蘭氏染色，于顯微鏡下鏡檢觀察，將鏡檢呈陽性球菌，鏈狀排布的單個菌落再次轉種于腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)18～24 h。

2.2.4 菌種的保藏 首先將丙三醇(甘油)與蒸餾水1∶1混勻在錐形瓶中，使得甘油濃度保持在50%，再通過高壓滅菌鍋121 ℃條件下高壓20 min。再將經多次分離純化后的葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌的菌液與50%甘油，按照1∶1比例各取500 μL加入無菌凍存管中混勻，最后置于-20 ℃冰箱儲存。

2.3 分離菌形態(tài)學觀察

使用接種環(huán)分別將純化后的三種菌液均勻涂抹在載玻片中央，將載玻片置于酒精燈外焰上3～5 cm處固定，經革蘭染色法染色后，在光學顯微鏡的100倍油鏡下觀察菌株形態(tài)。

2.4 分離菌株的PCR鑒定

依照DNA提取試劑盒操作步驟提取三種目標細菌DNA，于-20℃保存。

2.4.1 PCR鑒定 對提取的分離菌DNA進行PCR擴增，引物合成參考相關文獻[12-14]，引物序列及條件見表4，反應體系為25 μL:2 × Taq Plus Master mix Ⅱ12.5 μL,雙蒸水8.5μL，上下游引物各1μL,細菌DNA模板2 μL。反應程序為：

表4 PCR擴增條件及引物序列

①金黃色葡萄球菌：預變性95 ℃ 5min，95 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。

②大腸桿菌：預變性94 ℃ 5min，94 ℃變性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。

③無乳鏈球菌：預變性95 ℃ 5min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1min，72 ℃延伸2 min，進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。

擴增PCR產物片段小于700 bp的使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，大于700 bp的使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為：1×TAE電泳液，120 V，90 mA，40 min。用凝膠成像儀對電泳后的瓊脂糖凝膠進行分析。

2.5 分離菌株的藥物敏感性試驗

2.5.1 分離菌株的藥敏表型檢測 主要藥敏試紙選擇為：頭孢噻肟、青霉素、萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星、丁胺卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星等購自于杭州濱和微生物試劑有限公司。將多次分離純化后得到的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌，分別接種與LB肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床內增菌培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水將菌液濃度調節(jié)至(1～2)×10 CFU/mL。按照紙片法的操作，吸取適量菌液涂布在瓊脂平板上，取出不同藥敏紙片，貼于瓊脂表面，不同藥敏紙片的間距至少24 mm。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量瓊脂上的抑菌環(huán)直徑。評判結果均參照美國臨床實驗室國家標準化管理委員會標準(CLSI2008)。

3 結果與分析

3.1 分離菌株的初步鑒定及形態(tài)學特征

純化后的葡萄球菌菌液劃線于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基上長出的菌落顏色為金黃色菌落(且此菌落周圍的甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基的顏色也由最初透明的淡紅色變成了透明的淡黃色)；符合金黃色葡萄球菌的生長特性；該菌經革蘭氏染色后在顯微鏡下呈球型，排列呈葡萄串狀，無芽孢、鞭毛，無莢膜(詳見圖1)。

(a)甘露醇高鹽培養(yǎng)基 (b)金黃色葡萄球菌鏡檢照片(1 000×)

純化后的大腸桿菌菌液劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為玫紅色、邊緣光、濕潤的菌落；大腸桿菌經革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈現(xiàn)中等大小的革蘭氏陰性桿菌(圖2)。

(a)麥康凱培養(yǎng)基 (b)大腸桿菌鏡檢照片(1 000×)

純化后的鏈球菌菌液劃線于脫纖維無菌綿羊血瓊脂平板上的菌落出現(xiàn)灰白色菌落，菌落周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)：經革蘭氏染色后該菌在顯微鏡下呈現(xiàn)革蘭氏陽性球菌，鏈狀排布(圖3)。

(a)血瓊脂平板 (b)鏈球菌鏡檢照片(1 000×)

3.2 PCR鑒定結果

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，產物大小與預期大小一致，分別為264 bp、651 bp和345 bp(詳見圖4、5、6)；9個規(guī)?；膛鰳悠芳兓蟮木航汸CR鑒定后確定為金黃色葡萄球菌371株、大腸桿菌297株、無乳鏈球菌112株(詳見表5、表6)。

注：marker為DL 2 000 marker；M：Marker；1-14：部分金黃色葡萄球菌PCR鑒定；

注：marker為DL 700marker；M：Marker；1-10：部分大腸桿菌PCR鑒定；

注：marker為DL700marker；M：Marker；1-12：部分無乳鏈球菌PCR鑒定；

表5 9個規(guī)?；膛鲋氯榉垦字饕≡鷻z測奶牛頭數(shù)

表6 1236份乳樣細菌分離鑒定表

3.3 藥敏表型檢測結果

由表8可知，金黃色葡萄球菌對頭孢噻肟、萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星高度敏感；大腸桿菌對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星高度敏感；無乳鏈球菌對頭孢噻肟、萬古霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星高度敏感。

表7 不同藥物對三種致病菌的平均抑菌直徑(mm)

表8 藥敏試驗結果

4 討論

此次共采集乳樣1236份，1150份分離出病原菌，分離率達到93%，其中經革蘭氏染色、顯微鏡觀察后葡萄球菌742株，腸桿菌共531株，鏈球菌371株。最后通過特異性引物經PCR鑒定后共得到371株金黃色葡萄球菌、297株大腸桿菌、112株無乳鏈球菌。引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多，其主要致病菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌及停乳鏈球菌。本次分離結果以金黃色葡萄球菌居多，其次是大腸桿菌和無乳鏈球菌。細菌的分離和鑒定是防治奶牛乳房炎技術研究的基礎。根據(jù)本次實驗的藥敏結果顯示頭孢噻肟、環(huán)丙沙星效果最好，可為新疆部分地區(qū)奶牛場防治乳房炎的臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。為了減少耐藥性建議在進行乳房炎的治療時，用藥方式應采取輪換用藥。