★ 姚雪蓮 嚴(yán)志宏 王一帆 彭珊珊 蔡瑛 向汝群 范嘉華（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 南昌 330006）

順鉑是一種重要的癌癥化療藥物，廣泛用于卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌及非小細(xì)胞肺癌的治療［1］。但其全身毒性是治療成功的主要障礙，受到包括腎毒性、嘔吐和神經(jīng)毒性在內(nèi)的副作用的限制［2］。如何提高腫瘤病灶內(nèi)的藥物濃度以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，減少抗腫瘤藥物的用量以減輕全身毒副反應(yīng)，是目前腫瘤化學(xué)藥物治療中亟待解決的問(wèn)題。

磁性藥物載體具有磁靶向性，可使藥物精準(zhǔn)地輸送到病灶部位，降低了藥物的系統(tǒng)毒性，從而減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性，提高腫瘤局部的藥物濃度［3］。本研究擬采用共沉淀法制備Fe3O4MNPs，再進(jìn)行包硅和氨基功能化，在此基礎(chǔ)上裝載抗腫瘤藥物順鉑。以小鼠肺癌腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，考察載順鉑的磁納米藥物體系對(duì)小鼠肺癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、異丙醇、濃氨水、乙醇均為分析純，均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；水合肼，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；硅酸四乙酯（TEOS，99 %）、3-氨丙基三乙氨基硅烷（APTES，99 %）、溴化鉀、三乙胺、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自羅恩試劑；丙酮，分析純，購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；自制去離子水和蒸餾水；小鼠肺癌LLC細(xì)胞（CL-0140 Procell），購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

真空干燥箱（DZF-6020，寧國(guó)沙鷹科學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平（BS-214，北京賽多利斯儀器）；恒溫磁力攪拌器（85-2，上海司樂(lè)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，國(guó)華（常州）儀器制造有限公司）；超聲清洗儀（CSA-06BT，寧國(guó)沙鷹科學(xué)儀器有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet IS5型，美國(guó)Thermo公司）；掃描電子顯微鏡（FEI Quanta250，美國(guó)FEI公司），透射電子顯微鏡（HT7800，日立HITACHI）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-I600PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司）。CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（KGA317，江蘇凱基生物）；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit，MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物）；全自動(dòng)酶標(biāo)（WD-2102B，北京六一生物科技）；NovoCyte?流式細(xì)胞儀（NovoCyte 2060R，艾森生物<杭州>有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米顆粒Fe3O4的制備稱(chēng)取10.9 g FeSO4·7H2O和4.0 g FeCl3·6H2O 溶解于30 mL去離子水中，通入氮?dú)?，在機(jī)械攪拌器的攪拌下，加入2 mL水合肼，再逐滴加入35 mL濃氨水，調(diào)節(jié)溶液pH為9。攪拌30 min后，將反應(yīng)體系升溫至80 ℃老化1 h，停止反應(yīng)，用磁鐵進(jìn)行磁性分離，棄去上清液，用去離子水洗滌下層固體，再用無(wú)水乙醇洗滌，最后在真空干燥器中60 ℃干燥12 h，即得Fe3O4納米顆粒。

1.2.2 包硅磁納米顆粒（Fe3O4@SiO2）的制備取1 g上述制備的磁性Fe3O4納米粒子分散于裝有100mL異丙醇和8 mL去離子水的三頸燒瓶中，超聲15 min后，緩慢滴加10 mL濃氨水調(diào)節(jié)pH 8。再加入8 mL TEOS，45 ℃下快速攪拌，反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后磁場(chǎng)分離出磁流體，分別用去離子水和無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌。最后在真空干燥器中60 ℃干燥12 h，即得Fe3O4@SiO2納米粒子。

1.2.3 包氨磁納米顆粒（Fe3O4@SiO2-APTES）的制備取上述制得的Fe3O4@SiO2粒子6 g分散于80 mL無(wú)水乙醇，加入12 mL APTES，2 mL三乙胺，快速攪拌24 h，產(chǎn)物用去離子水和無(wú)水乙醇洗滌，洗滌后置于60 ℃真空干燥，即得Fe3O4@SiO2-APTES的棕褐色粉末。

1.2.4 載順鉑磁納米藥物體系的制備分別稱(chēng)取2 mg順鉑和20 mg Fe3O4@SiO2-APTES磁納米粒子，共分散于5 mL丙酮中，60 ℃攪拌1 h，在外加磁場(chǎng)作用下得到產(chǎn)物，用去離子水反復(fù)洗滌后，置于真空干燥箱中干燥。

1.2.5 載順鉑磁納米體系特征檢測(cè)將真空干燥后的載順鉑納米粒子與 KBr研磨混合并壓片制得透明薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀,分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)70，掃描范圍400～4 000 cm-1。將真空干燥的載順鉑納米粒子置于電鏡樣品臺(tái)上，分別采用掃描電鏡和透射電鏡觀察其形貌、粒徑。

1.2.6 載順鉑磁納米體系的載藥量及包封率的測(cè)定取載順鉑磁納米粒子分散于DMSO中，離心，取上層清液2 mL，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在305nm波長(zhǎng)下的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出殘液中順鉑藥物的含量。按照公式計(jì)算其載藥量和包封率并對(duì)比。載藥量（%）=（順鉑總量-順鉑殘余量）/載藥納米粒子總量×100 %；包封率=（順鉑總量-順鉑殘余量）/順鉑總量×100 %［4］。

1.2.7 載順鉑磁納米體系的體外藥物釋放將40 mg載順鉑磁納米顆粒分散于8 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）后轉(zhuǎn)移到透析袋（分子截留量300.5）中，加入9倍體積PBS釋放介質(zhì)，并在37℃的恒溫水浴中以100 r/min振蕩, 分別于不同時(shí)刻取出2mL釋放介質(zhì)作為樣品, 并加入等量新鮮介質(zhì),測(cè)定其在 305 nm下的吸光度值，取3次實(shí)驗(yàn)平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出順鉑的累積釋放量。

1.2.8 CCK8檢測(cè)磁性納米載體的細(xì)胞毒性培養(yǎng)LLC細(xì)胞系，接種于96孔板中（7×103個(gè)/孔）培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的（6.25，12.5，25，50，100 μg/mL）載藥磁納米粒子，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將處理后的細(xì)胞每組換成相同培養(yǎng)基100 μL，每孔加入10 μL CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光值。檢測(cè)細(xì)胞的存活率，看各濃度下細(xì)胞的存活率，計(jì)算IC50值。

1.2.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè)LLC細(xì)胞以5×105/mL細(xì)胞懸液孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)至狀態(tài)良好后造模組加入含有載藥磁納米粒子的培養(yǎng)液（75.36 μg/mL），培養(yǎng)24 h后胰酶消化收集所有細(xì)胞，PBS洗兩遍，加500 μL預(yù)冷的1×Binding Buffe，每管各加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD輕微混勻后，室溫避光孵育10 min上流式儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，定量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組之間定量數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 磁納米藥物載體的物理表征 磁納米藥物載體的紅外光譜圖見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，585 cm-1為Fe-O鍵伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的峰，即Fe3O4的特征峰；1 090 cm-1為Si-O-Si所產(chǎn)生的特征峰；2 990 cm-1處的特征峰對(duì)應(yīng)了-CH2-中碳?xì)滏I的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的峰；3 444 cm-1為-NH2中N-H的伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的峰。

圖1 紅外光譜圖

磁納米粒子的電鏡圖見(jiàn)圖2。圖2（a）是Fe3O4粒子，可見(jiàn)其粒子外觀呈球形，平均粒徑約為10 nm；圖2（b）是載順鉑的Fe3O4@SiO2-APTES納米粒子，可見(jiàn)其粒子為球形，平均粒徑為250 nm，分散良好。

圖2 Fe3O4粒子的透射電鏡圖（a）和載順鉑磁納米藥物的掃描電鏡圖（b）

磁納米藥物載體的磁性表征的VSM圖見(jiàn)圖3。由圖可知其磁飽和值分別為0.390 5 emu/mg，這個(gè)結(jié)果表明，該磁納米藥物體系有較好的磁響應(yīng)能力，在外加磁場(chǎng)作用下能夠快速有效地與基質(zhì)分離，有較好的磁靶向性。

圖3 磁納米藥物載體的VSM圖

2.2 載藥量及包封率測(cè)定 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，以順鉑濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制線性回歸曲線，得線性方程Y=0.360 5X-0.487 3（R2=0.9833）。根據(jù)載藥率及包封率公式可以確定載藥量，得出順鉑載藥率為6.18 %，包封率為60.12 %。

2.3 載順鉑磁納米體系的體外藥物釋放 載順鉑磁納米體系的體外藥物釋放率見(jiàn)圖4。從圖中可見(jiàn)，該磁納米粒子在1 h內(nèi)迅速釋放所載順鉑總量的50 %，剩余的順鉑在24 h內(nèi)從納米粒中緩慢釋放達(dá)到89 %。

圖4 累積藥物釋放率

2.4 CCK8檢測(cè)結(jié)果 與正常組相比，加入不同濃度的載藥磁納米粒子作用細(xì)胞后細(xì)胞的存活率下降，且隨著作用濃度的增加，細(xì)胞的存活率下降（P<0.05），半抑制濃度為75.36 μg/mL。見(jiàn)圖5。

圖5 細(xì)胞CCK8檢測(cè)及IC50結(jié)果

2.5 流式檢測(cè)結(jié)果 與空白組相比，加入載藥磁納米粒子作用細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率顯著增大（P<0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 流式檢測(cè)凋亡結(jié)果

3 結(jié)論

本文制備了以Fe3O4為核心的磁納米粒子，并進(jìn)行包硅、氨基功能化修飾，然后裝載抗腫瘤藥物順鉑，并研究了納米載藥體系對(duì)化療藥物順鉑的運(yùn)載率及納米載藥體系對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的體系具有較高的生物相容性、良好的磁靶向性和體外抗肺癌活性，為進(jìn)一步的體內(nèi)治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。