肖牧原

（安徽省食品藥品信息與舉報中心，安徽 合肥 230051）

薄荷味辛、性涼[1]，常用于治療頭痛、牙痛、傷寒、目赤、喉痹、蕁麻疹、咽喉腫痛等病癥[2]。其含大量黃酮類物質，有抗自由基和抗氧化作用，治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。⒗夏晷园V呆、癌癥等也有一定效果。近年來，關于薄荷中黃酮類化合物的研究備受關注，多種相關藥品[3]和保健食品隨之上市。薄荷總黃酮的常見提取方法為回流提取法，操作簡單，提取溫度穩(wěn)定，但提取時間長，耗能大，對產品結構有影響，提取效率不高。超聲波提取法利用超聲波所產生的高速、強烈空化效應，破壞動植物的細胞，加快提取劑的滲透作用，從而在較短時間內得到較高提取率[4]，但超聲波的功率過高也可能破壞分子結構[5-6]。本研究中采用低功率超聲法提取薄荷總黃酮，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法[7]優(yōu)選最佳醇提工藝，并采用Fetion 反應考察薄荷總黃酮的抗氧化活性?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：UV-1100 型紫外-可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；JK-100DVE 型雙頻數控超聲波清洗儀（合肥金尼克機械制造有限公司）；FW100 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；FQA2104BS 型電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司）。

試藥：薄荷購于安徽省亳州市康美中藥城；蘆丁對照品（批號為20191228，純度＞98% ）購于合肥博美生物技術有限公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線繪制

參考文獻[8]制備質量濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁對照品溶液，分別移入含蘆丁對照品1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 的50 mL 容量瓶中，加水稀釋至12 mL，然后加入1 mL 5 % NaOH 溶液，再加入1 mL 10 %NaNO2溶液，搖勻，靜置10 min，加入10 mL 4 % Al（NO3）3溶液，充分顯色，加水定容，測量508 nm 波長處的吸光度（A），以A為縱坐標、質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.2.2 薄荷總黃酮提取率計算[9-10]

按1.2.1 項下方法進行顯色反應，測定A，根據標準曲線查找對應的質量濃度，代入公式Y=CVN/ （M×1000） ×100%計算薄荷總黃酮的提取率。其中Y為提取率（%），C為待測物質量濃度（mg/mL），V為提取液的體積（mL），N為稀釋倍數，M為樣品質量（g）。

1.3 單因素試驗[11-13]

將陰干后的薄荷藥材樣品粉碎后過篩，稱取1.00 g，精密稱定，置相同規(guī)格比色管中，保持恒定的提取溫度（50 ℃）和超聲波功率（100 W），選取乙醇的體積分數、液料比和提取時間作為影響因素，每個因素確定6 個水平，分別進行3 次平行試驗（見表1）。抽濾后取2 mL 濾液按1.2.1 項下方法顯色，測定508 nm 波長處的吸光度，并按1.2.2 項下公式計算總黃酮提取率。

表1 影響因素及水平條件Tab.1 Influencing factors and their levels

1.4 響應面試驗設計[14-16]

根據單因素試驗結果，將乙醇體積分數、液料比和提取時間設定為因素A、因素B、因素C，每個因素的3 個水平編碼為+1，0，-1，設計3 因素3 水平的響應面試驗，試驗方案見表2。

表2 響應面試驗設計方案Tab.2 Design of response surface methodology

1.5 抗氧化活性試驗[17-19]

根據Fetion 反應，H2O2溶液和Fe2+生成具有較高反應活性的羥基自由基（·OH），·OH 與水楊酸反應，生成2，3-二羥基苯甲酸（顯色反應機制見圖1）。2，3-二羥基苯甲酸的紫外可見吸收峰出現在510 nm 波長處，故將檢測波長換為510 nm，按1.2.1 項下方法操作，得回歸方程A=10.475C-0.0077，R2=0.99892（n=5），質量濃度線性范圍為0.004 ～0.020 mg/mL。但當體系中有其他物質也能與·OH 反應時，就會存在與水楊酸的競爭反應，從而降低2，3-二羥基苯甲酸在體系中的質量濃度，510 nm 波長處的吸收峰會相應減小。

圖1 顯色反應機制Fig.1 The mechanism of color reaction

用固定反應時間的方法，在5 根比色管中均加入9 mmol/L 的H2O2、FeSO4溶液、水楊酸乙醇溶液各1 mL，將薄荷總黃酮提取液分別稀釋至20%，40%，60%，80%，100 %，各取1 mL，在35 ℃條件下，水浴40 min，測量508 nm 波長處的吸光度（AX），并以去離子水作空白對照，同法得空白吸光度（A0），由于樣品溶液本身具有吸光度，測其本底值時用超純水作本底對照，同法得本底吸光度（AX0），計算清除率（P）。P= [A0-（AX-AX0）]/A0×100%。

2 結果

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數

結果見圖2。隨著乙醇體積分數從20%升至40%，薄荷總黃酮的提取率逐漸升高，當乙醇體積分數繼續(xù)上升，提取率反而快速下降。主要原因可能是乙醇的體積分數對提取液極性的影響。40 %乙醇的極性與被提取化合物的極性最接近，相似相容的效果最好，當乙醇體積分數小于或大于40 %時，薄荷總黃酮類化合物的溶解性變小，同時部分脂溶性物質的溶解度增加，使得薄荷總黃酮類化合物不能完全浸出[20]。故40 %乙醇體積分數為最佳。

圖2 體積分數與提取率的變化關系Fig.2 Relationship between volume fraction and extraction rate

2.1.2 液料比與提取率的變化關系

結果見圖3。薄荷總黃酮的提取率隨著液料比的增大，先增后減。液料比為20 ∶1 時提取率達到最大值，之后下降。因為隨著溶劑量增多，傳遞功率增大，薄荷總黃酮在溶劑中分散量增大。同時，擴散溶解和吸附是固相和液相兩者之間的動態(tài)平衡，當體系產生的熱量相同時，液料比的增大會降低提取液的溫度，此時吸附作用增強，提取率會下降。故20 ∶1 為合適液料比[21]。

圖3 液料比與提取率的變化關系Fig.3 Relationship between the liquid-material ratio and extraction rate

2.1.3 提取時間與提取率的變化關系

結果見圖4。薄荷總黃酮提取率在提取90 min 時達到峰值，90 min 前，由于升高溫度可增大溶解性，提取率與時間呈正比，但提取時間過長，黃酮類化合物可能會發(fā)生系列化學變化，產生新的物質，從而導致提取率減小。故提取時間在90 min 左右為宜[22]。

圖4 提取時間與提取率的變化關系Fig.4 Relationship between extraction time and extraction rate

2.2 響應面法優(yōu)化工藝

響應面試驗因素水平及結果見表3、表4，運用Design-Expert8 軟件對結果進行擬合分析，得方程Y=3.65-0.00295A +0.29B +0.086C +0.01AB +0.078AC- 0.015BC-0.18A2-0.47B2-0.32C2。對該模型進行方差分析和顯著性檢驗分析[23]（見表5、表6），顯示該模型的失擬項不顯著，說明模型能較好地對工藝進行模擬。模型回歸的F值為12.77，概率P值為0.001，表明模型具有顯著性。表中數據顯示，B 和B2兩項有極顯著影響（P＜0.001），A2和C2兩項有顯著影響（P＜0.05），而A，C，AB，AC，BC 項的影響不顯著。校正決定系數為0.8689，表明方程擬合度較好。變異系數為4.58%，說明試驗精確可行。決策系數為0.9426，說明模型響應值的變化94.26%來自所選的因變量，回歸方程能較好地描述其與響應值之間的關系。

表3 響應面試驗因素水平及編碼Tab.3 Factors′ levels and coding of response surface methodology

表4 響應面試驗結果Tab.4 Results of response surface methodology

2.3 響應曲面分析

結果見圖5 至圖7。3 個響應曲面均向下，具有最高的極值點。同時，等高線的中心在所選2 個因素的變化范圍內，說明響應值在3 個因素設計的范圍內存在最大值。圖5、圖6 中的等高線呈橢圓形，說明各圖2 個影響因素間的交互效應較顯著，圖7 中的等高線呈圓形，則說明2 個影響因素間的交互效應不顯著。

表6 回歸模型方差分析Tab.6 Analysis of variance of regression model

圖5 乙醇體積分數和液料比的交互影響Fig.5 Interaction of ethanol volume fraction and liquid-solid ratio

圖6 乙醇體積分數與提取時間的交互影響Fig.6 Interaction of ethanol volume fraction and extraction time

圖7 液料比與提取時間的交互影響Fig.7 Interaction of liquid-solid ratio and extraction time

2.4 最佳工藝條件確定

根據回歸模型，預測在50 ℃溫度條件下，100 W 超聲提取薄荷總黃酮時最佳工藝條件為乙醇體積分數41.14%，液料比21.57 ∶1（mL/g），提取時間91.4 min，此時提取率為3.585%。為進一步確定模型的可行性，將最佳提取工藝修正為乙醇體積分數41 %，液料比22 ∶1（mL / g），提取時間92 min，進行4 次驗證試驗，結果提取率分別為3.486% ，3.339% ，3.452% ，3.363%，平均為3.426%，與理論預測值的標準誤差為3.04%，證明通過響應面法優(yōu)化所得最佳工藝條件真實可靠。

2.5 抗氧化活性分析

隨著薄荷總黃酮質量濃度的增大，其對羥基自由基的清除能力也呈快速上升趨勢。當自由基清除率達50%后，清除率隨薄荷總黃酮的質量濃度變化逐漸趨于平緩。詳見圖8。

圖8 薄荷總黃酮質量濃度對自由基清除率的影響Fig.8 Effect of the concentration of total flavonoids from Mentha haplocalyx on the scavenging rate of free radical

3 討論

本研究中在低功率超聲作用下優(yōu)選乙醇浸提薄荷總黃酮的工藝，首先通過單因素試驗初步考察了乙醇體積分數（A）、液料比（B）和提取時間（C）3 個因素的工藝參數范圍，然后運用響應面法進行工藝參數的優(yōu)化。結果分析顯示，100 W 超聲作用下，50 ℃時，最佳的薄荷總黃酮提取工藝條件為，以41.14 %乙醇、液料比21.57 ∶1（mL/g）提取91.4 min，所得薄荷總黃酮的提取率為3.585%?？寡趸钚栽囼灲Y果表明，該提取物能去除50%的羥基自由基，具有穩(wěn)定的抗氧化活性。本研究結果為薄荷總黃酮的提取和生產提供了參考。