劉學(xué)良，姚俊修，劉翠蘭，李善文，任 飛，李慶華，吳海濤，翟紅蓮，吳德軍，邢世巖，高紅萍

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省林業(yè)科學(xué)研究院 山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250014；3.山東博華高效農(nóng)業(yè)生態(tài)有限公司，山東 濱州 256500；4.吉林省大安市四棵樹鄉(xiāng)政府林業(yè)站，吉林 大安 137000）

接骨木Sambucus williamsii系忍冬科Caprifoliaceae接骨木屬Sambucus落葉灌木或小喬木。接骨木的果實含油量豐富，且油質(zhì)較好，在我國大力倡導(dǎo)發(fā)展的新型木本油料樹種中具有很大的開發(fā)價值。接骨木在抗炎、鎮(zhèn)痛、促進骨折愈合、抗骨質(zhì)疏松、增強免疫活性、提高學(xué)習(xí)記憶力、降血脂、軟化血管等方面具有一定的藥用價值。接骨木根系發(fā)達，萌蘗性強，較耐旱，耐寒，廣泛分布于北至黑龍江，南至廣東的我國各地區(qū)[1-3]。目前，部分地區(qū)正將接骨木作為荒山綠化樹種，成效顯著且價格低廉。

土壤鹽漬化治理是世界性難題。其中，干旱、半干旱地區(qū)尤為嚴重。據(jù)有關(guān)部門不完全統(tǒng)計，全世界鹽漬土地面積約為9.54 億hm2[4]，從沿海到內(nèi)陸，隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境的污染越來越嚴重[5]，土壤的鹽漬化已成為制約我國灌溉農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[6]。鹽漬化主要是因為土壤中含有大量NaCl 等中性可溶性鹽導(dǎo)致，當(dāng)土壤中可溶性鹽達到一定含量時，會破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致土壤物理指標(biāo)發(fā)生嚴重惡化[7]。植物根系在吸收土壤中營養(yǎng)元素時，將大量鹽分一起吸收，導(dǎo)致植物細胞中滲透壓、酶活性等生理生化指標(biāo)發(fā)生變化，從而對植物產(chǎn)生顯著危害，甚至導(dǎo)致死亡。在植物的發(fā)展進化中也產(chǎn)生了一些抵抗機制來避開鹽害脅迫。根部通過選擇性吸收無機離子，植物體系統(tǒng)統(tǒng)調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)體內(nèi)各物質(zhì)的含量，各種酶活性，調(diào)節(jié)根、莖、葉的生理、形態(tài)等指標(biāo)等方式來提高耐鹽性[8]。通過查閱文獻，目前對接骨木屬樹種的研究僅局限于資源概述[9]、藥用及油用研究[3,10]、栽培模式、無性繁殖及分子標(biāo)記開發(fā)等方面[11-13]，而對接骨木不同種無性系耐鹽性相關(guān)研究未見報道，因接骨木具有易繁殖、抗干旱、耐瘠薄等特點，對其耐鹽性進行研究，旨在為鹽堿地、瘠薄山地等困難造林地提供良種，對于鹽堿地等困難立地的生態(tài)建設(shè)起到顯著的示范和促進作用。鑒于此，本研究對3 個不同種接骨木（接骨木Sambucus williamsii；西洋接骨木Sambucus nigra；金葉接骨木Sambucus canadensis‘Aurea’）的7 個無性系在受到NaCl 鹽脅迫產(chǎn)生生長生理等指標(biāo)的變化，并對相關(guān)指標(biāo)進行綜合評價，從而初步確定不同種接骨木的耐鹽能力，進一步豐富鹽堿地造林材料。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗于山東省濱州市博興縣山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司進行。濱州博興縣位于118°04′～118°22′E、36°58′～37°27′N 之間，屬典型的溫帶季風(fēng)型大陸性氣候，光照充足，雨水豐盈，氣候宜人。年平均降水量601 mm，無霜期180 d。年平均氣溫12.5℃，全年日照時數(shù)2 595 h，可滿足農(nóng)作物光照和熱量需要。

1.2 試驗材料

2017年2月中旬從山東各地取接骨木優(yōu)株（優(yōu)株樹齡20 a 左右）當(dāng)年生粗細相近枝條作插穗進行扦插，試驗采用接骨木屬3 個種7 個無性系（表1）于山東省濱州市博興縣博華高效農(nóng)業(yè)科技有限公司基地扦插于35 cm×30 cm 的塑料花盆中，每盆扦插1 穗，每無性系扦插60 盆。扦插基質(zhì)由普通土壤和草炭土1:1 混合均勻而成，其土壤理化性質(zhì)為：有機質(zhì)含量37.40 g/kg，有效氮200.07 mg/kg，有效磷420.31 mg/kg，有效鉀653.95 mg/kg，土壤pH 值7.58，含鹽量為2.45‰。田間最大持水量59.9%，每盆土壤干質(zhì)量10 kg。

表1 試驗材料Table 1 Experimental materials

1.3 研究方法

2017年7月20日從接骨木無性系生長量基本一致的苗木中選取16 株參與試驗，整個試驗在人工搭建的遮雨棚下進行，以避免外界雨水干擾。試驗設(shè)計4 個處理，每處理4 次重復(fù)[14]；首先將試驗所用苗木充分灌溉，經(jīng)過控水處理，使得每盆的含水量相對一致，再分別用0‰（T0：對照）、2‰（T1）、4‰（T2）、6‰（T3）4 個 不同濃度的NaCl 溶液進行脅迫處理。試驗開始后每次每盆澆鹽溶液500 mL，4～5 d 澆鹽溶液一次。盆底部墊有花盆托和20 cm 高的塊磚。每天下午將花盆托中的滲出液體倒回盆中，采用稱重法對每盆苗木進行補水，確保土壤相對含水量維持在75%～80%。鹽脅迫處理時間44 d，當(dāng)鹽脅迫達到一定濃度后，觀察植株變化，陸續(xù)取樣測定各指標(biāo)，總實驗周期在100 d 左右。采樣時土壤最終鹽分狀況如表2所示。取樣時，每植株均剪取中部健壯枝條從頂端數(shù)第3、4 個復(fù)葉葉片進行生理生化指標(biāo)的測定，每次每個測定指標(biāo)重復(fù)測定3次。

表2 土壤相對含鹽量Table 2 Relative salt content of soil

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 生長指標(biāo)的測定

試驗初始，用5 m 卷尺和游標(biāo)卡尺對所有參與試驗的苗木進行株高H0和地徑B0的測定。試驗結(jié)束后，再次測定所有接骨木試驗苗的苗高H1和地徑B1。分別計算苗高增量（H1-H0）和地徑增量（B1-B0）。

生物量和根冠比的測定：試驗開始時，在不同或者相同無性系中選取3 株生長勢較為平均的完整植株，用去離子水清洗植株的根、莖、葉上的雜質(zhì)并擦干后于105℃下烘干至恒質(zhì)量，測定每株無性系的生物量，取其平均值為生物量1。試驗結(jié)束后，在不同無性系中分別選取3 株生長勢較為平均的完整植株，用去離子水清洗植株的根、莖、葉上的雜質(zhì)并用吸水紙快速吸干后于105℃下烘干至恒質(zhì)量，測定每株無性系的生物量，不同無性系平均值均設(shè)定為生物量2。計算不同無性系生物量增量（生物量2-生物量1），根冠比為試驗結(jié)束后所測根冠比。

1.4.2 生理指標(biāo)的測定

Key word: ice and snow tourism; ice and snow tourism culture; ice and snow tourism resources

通過計算相對電導(dǎo)率得出其細胞膜透性，葉綠素含量由乙醇萃取法測定，由氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，可溶性糖含量由蒽酮光度法測定，脯氨酸（Pro）含量由茚三酮反應(yīng)顯色法檢測[15]。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，運用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)的單因素方差分析、Duncan’s 法進行多重比較和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期高增長量的影響

在NaCl 脅迫下，7 個接骨木無性系的苗高增長量表現(xiàn)出下降的趨勢（圖1）。NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期高生長抑制明顯，其苗高增長量隨NaCl 脅迫濃度的增加而減小。本試驗JY-1、XY-1、XY-3 和XY-2 在4 種環(huán)境處理下苗高增長量 是PT-2、PT-3 和PT-1 的1.5～2.0 倍。在T3濃度時，無性系XY-2 是PT-2 的3.3 倍。較對照T0，無性系XY-2 的降幅最小，僅為14.9%，表現(xiàn)較強耐鹽性。

圖1 NaCl 脅迫對苗高增長量的影響Fig.1 Effect of NaCl stress on growth of height

2.2 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期地徑增長量的影響

隨著NaCl 溶液濃度的增加，7 個接骨木無性系地徑增長量均出現(xiàn)不同程度的下降趨勢（圖2）。NaCl 溶液會抑制植物的生長，其地徑增長量受抑制是主要表現(xiàn)方面之一。在T2和T3的處理脅迫下，XY-3 和XY-2 無性系的地徑增長量最大，說明這2個接骨木無性系受NaCl 鹽分脅迫抑制較輕。

圖2 NaCl 脅迫對地徑增長量的影響Fig.2 Effect of NaCl stress on ground diameter increment

2.3 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期根冠比的影響

低濃度NaCl 鹽溶液對植物根系的生長有促進作用，而高濃度NaCl 鹽脅迫對地上器官的傷害大于對地下部位的傷害程度（圖3）。本試驗中，在4 個處理環(huán)境下，較對照T0，接骨木無性系PT-2 的根冠比始終是最大的，變化幅度最大的接骨木無性系是JY-1 和XY-3，增幅分別為84.0%和88.2%。

圖3 NaCl 脅迫對根冠比的影響Fig.3 Effect of NaCl stress on root shoot ratio

2.4 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期生物量的影響

本試驗中，生物量最大的接骨木無性系為PT-2和PT-1（圖4）。在4 個處理環(huán)境下，變化幅度最小的接骨木無性系是PT-2 和XY-2，分別為12.0%和23.1%。表明NaCl 鹽脅迫對PT-2 和XY-2 的抑制程度較低。

圖4 NaCl 脅迫對生物量的影響Fig.4 Effect of NaCl stress on biomass

2.5 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期細胞膜透性的影響

圖5 NaCl 脅迫對細胞膜透性的影響Fig.5 Effect of NaCl stress on membrane permeability

2.6 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期葉綠素含量的影響

接骨木無性系XY-2 在T1環(huán)境下葉綠素含量急劇下降，降幅達到31.9%（圖6）。此時光合作用極有可能受到抑制。在T3環(huán)境下，較對照T0，XY-3 的葉綠素含量最大，達到6.65 mg/g，下降幅度為44.3%，呈顯著性差異。JY-1 的葉綠素含量最低，為4.07 mg/g，降幅為33.0%，表明在NaCl鹽脅迫下無性系XY-3 的光合作用受抑制較小，無性系JY-1 光合作用受抑制較大。

圖6 NaCl 脅迫對葉綠素含量的影響Fig.6 Effect of NaCl stress on chlorophyll content

2.7 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期SOD 活性的影響

隨著NaCl 溶液脅迫的增加，7 個接骨木無性系SOD 活性均不同程度地出現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖7）。在輕度鹽脅迫T2環(huán)境下，各接骨木無性系的SOD 活性達到最大值，表明在此NaCl鹽濃度處理下7 個無性系超氧化物歧化酶（SOD）活性達到最大耐受值。較對照T0，增幅最大的無性系為XY-3 和JY-1；增幅最小的無性系為PT-1和XY-2，分別為16.0%和17.6%。當(dāng)NaCl 溶液濃度達到T3環(huán)境濃度時，較對照T0，7 個無性系SOD 活性出現(xiàn)下降趨勢。其中，SOD 活性最大且下降幅度最大的無性系為XY-2，下降幅度為21.6%；下降幅度最小的無性系為JY-1，下降幅度為1.0%。表明無性系XY-2 受高濃度NaCl 鹽脅迫影響較大，無性系JY-1 受影響較小。

圖7 NaCl 脅迫對SOD 活性的影響Fig.7 Effect of NaCl stress on SOD activity

2.8 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期可溶性糖含量的影響

隨著NaCl 溶液濃度的增加，7 個接骨木無性系可溶性糖含量均出現(xiàn)不同程度的上升趨勢（圖8）。NaCl 鹽脅迫下，植物可溶性糖會大量集聚，從而提高植物的耐鹽能力。可溶性糖含量上升幅度最大的無性系為XY-3 和XY-1；可溶性糖含量上升幅度最小的無性系為PT-3 和JY-1，較對照T0，上升幅度達28.3%和60.1%。表明無性系XY-3 和XY-1 的可溶性糖含量受NaCl 鹽脅迫影響較大，無性系PT-3 和JY-1 的可溶性糖含量受NaCl 鹽脅迫影響較小。

圖8 NaCl 脅迫對可溶性糖含量的影響Fig.8 Effect of NaCl stress on soluble sugar content

2.9 NaCl 脅迫對接骨木無性系苗期脯氨酸含量的影響

隨著NaCl 溶液濃度的增加，7 個接骨木無性系脯氨酸含量均出現(xiàn)不同程度的上升趨勢（圖9）。本試驗中，較對照T0，上升幅度最大的無性系為XY-3 和PT-2；上升幅度最小的無性系為JY-1 和PT-1，分別為54.5%和84.1%。表明無性系XY-3和PT-2 的輔氨酸含量受NaCl 鹽脅迫影響較大，無性系JY-1 和PT-1 的輔氨酸含量受NaCl 鹽脅迫影響較小。

圖9 NaCl 脅迫對脯氨酸含量的影響Fig.9 Effect of NaCl stress on proline content

2.10 主成分分析

對7 個接骨木無性系所測的所有指標(biāo)進行主成分分析，結(jié)論見表3。在T2環(huán)境脅迫下，第1主成分貢獻率為46.629%，第2 主成分貢獻率為26.265%，第3 主成分貢獻率為14.588%，前三主成分累計貢獻率達87.482%。根據(jù)各指標(biāo)成分值的大小可知，在T2環(huán)境處理下，影響主成分較大的指標(biāo)有株高增量、地徑增量、細胞膜透性、可溶性糖含量等4 個指標(biāo)。在T3環(huán)境處理下，第1主成分貢獻率為38.657%，第2 主成分貢獻率為27.568%，第三主成分貢獻率為19.346%。前三主成分累計貢獻率達85.570%。結(jié)合主成分分析進行綜合評價，得到7 個接骨木無性系耐鹽能力，由強到弱為XY-2、XY-3、XY-1、JY-1、PT-1、PT-3、PT-2（表4）。西洋接骨木的耐鹽能力強于接骨木，金葉接骨木（加拿大接骨木變種）的耐鹽能力介于西洋接骨木與接骨木之間。

表 3 無性系NaCl 脅迫主成分分析Table 3 Principal components of NaCl stress of clones

表4 7 個無性系的主成分值Table 4 First principal component value of seven clone

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

在不同濃度NaCl 鹽分脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)生長生理反應(yīng)機制來使植物保持生命機能平衡。7個接骨木無性系在不同NaCl 鹽濃度脅迫下，生長指標(biāo)株高、地徑的增長量隨NaCl 濃度的增加呈下降趨勢。說明NaCl 鹽脅迫越大，越不利于接骨木生長發(fā)育[14]。根系是與NaCl 脅迫溶液接觸最密切的器官，對NaCl 鹽脅迫也是較為敏感的器官，當(dāng)植物受到NaCl 鹽分脅迫時，NaCl 鹽分對根莖葉的傷害程度也是不同的，在高濃度NaCl 鹽脅迫下，植物器官受影響程度依次是葉、莖、根。地上部位受影響程度比地下部位嚴重[16]。導(dǎo)致地上部位生物量增長小于地下部位。因此，NaCl 鹽脅迫下根冠比增加[17]。本試驗研究表明，在NaCl 鹽脅迫下，由于接骨木不同器官對NaCl 鹽分的適應(yīng)性不同，其生物量的分配策略會有所改變，根冠比會發(fā)生改變。接骨木根冠比隨NaCl 溶液濃度增加而增加。

當(dāng)植物受到NaCl 鹽分脅迫時體內(nèi)的活性氧自由基會大量生成，導(dǎo)致細胞膜上的磷脂分子因氧化而受到嚴重破壞，從而引起細胞膜透性的變化甚至喪失，植物葉片的電解質(zhì)外滲，相對電導(dǎo)率會因磷脂分子受到破壞程度的不同而不同[16]。本試驗研究表明，接骨木7 個無性系細胞膜透性隨NaCl 鹽脅迫的增加而增加，這與黨曉宏等[18]研究NaCl 脅迫對3 種濱藜屬Atriplex植物幼苗葉片的細胞膜透性生理響應(yīng)結(jié)果一致。

葉綠素是一類含脂的綠色色素，在植物進行光合作用中起著不可替代作用。葉綠素極易受到光、酸、堿、氧、氧化劑等外界條件的干擾而分解[19]。在NaCl 鹽分脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，從而導(dǎo)致葉綠素分解。光合作用受到影響，植物的生長發(fā)育受到抑制[18]。本試驗結(jié)果表明，隨著NaCl 溶液濃度的增加，7 個接骨木無性系葉綠素含量均出現(xiàn)不同程度的降低趨勢。超氧化物歧化酶（SOD）是一種抗氧化酶，能夠消除生物體內(nèi)氧化自由基等有害物質(zhì)。在生物體內(nèi)抗氧化機制中起著十分重要的作用。在NaCl 鹽分脅迫下，為了盡快消除細胞內(nèi)過量產(chǎn)生的氧自由基，抑制細胞膜上的磷脂分子的破壞，植物自身誘導(dǎo)體內(nèi)SOD 活性加強適應(yīng)脅迫環(huán)境[20]。當(dāng)NaCl 鹽分濃度過大時，SOD 的合成受到抑制，降解速率加快，導(dǎo)致活性下降，抗氧化效率降低[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl 溶液濃度的增加，7 個接骨木無性系SOD 含量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與賈漫麗等[23]研究鹽脅迫對4 個桑樹Morus alba品種的超氧化物歧化酶的影響變化趨勢一致。

可溶性糖對細胞膜和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性具有一定的保護作用，參與構(gòu)建細胞內(nèi)有機碳架和合成能量，當(dāng)細胞內(nèi)無機離子濃度過高時可溶性糖可以起到保護酶活性的作用，是參與滲透調(diào)節(jié)重要的物質(zhì)之一[24]。而脯氨酸不僅是生物體內(nèi)很好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是細胞膜結(jié)構(gòu)和生物酶活的保護物質(zhì)，也是自由基的清除劑，在植物受到NaCl 鹽分脅迫時起到保護作用，脯氨酸還可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)鉀離子在液泡中的含量情況來對細胞質(zhì)滲透平衡進行調(diào)節(jié)，以保證植物正常代謝生長[25]。本試驗表明，當(dāng)NaCl 溶液濃度升高時，7 個接骨木無性系的可溶性糖出現(xiàn)不同程度的提高，這與方志紅等[26]研究NaCl 脅迫對堿蒿Artemisia anethifolia的莖葉中可溶性糖含量逐漸增加的結(jié)果一致。隨著NaCl溶液濃度的不斷升高，當(dāng)7 個接骨木無性系受到NaCl 鹽脅迫后，其細胞內(nèi)的脯氨酸含量也出現(xiàn)不同程度的升高。這與孫聰聰?shù)萚27]研究NaCl 脅迫后期對銀杏幼樹脯氨酸代謝的影響結(jié)果一致，也與楊傳寶等[14]對白楊派無性系苗期脯氨酸對NaHCO3脅迫的響應(yīng)結(jié)果一致。

本次試驗運用主成分分析將上述多個指標(biāo)進行分析，得出7 個接骨木無性系耐鹽順序為XY-2＞XY-3＞XY-1＞JY-1＞PT-1＞PT-3＞PT-2。耐鹽最佳的2 個接骨木無性系為XY-2、XY-3（均為西洋接骨木）；當(dāng)然本研究也存在一定局限性，試驗僅通過對以上7 個接骨木無性系的9 個生長生理指標(biāo)進行測定評價，其結(jié)果只能說明7 個接骨木無性系在這9個指標(biāo)上耐鹽能力的大??；另外，本試驗采用接骨木半年生扦插盆栽苗進行試驗，而林木耐鹽堿能力在不同發(fā)育階段及不同環(huán)境下，其適應(yīng)性會發(fā)生變化，因此，下一步將對接骨木無性系其它生長生理指標(biāo)的變化，如根系活力、內(nèi)源激素含量變化等進行研究，同時對大田中成年接骨木的耐鹽能力進行綜合評價，以進一步驗證該結(jié)論。

3.2 結(jié) 論

本研究采用盆栽試驗的方法，利用不同濃度的NaCl 溶液進行脅迫處理，分析不同處理下各無性系的各指標(biāo)變化，并對其進行綜合評價，確定其耐鹽性，為鹽堿地造林提供優(yōu)良無性系。研究發(fā)現(xiàn)，隨NaCl 鹽分濃度的不斷增大，7 個接骨木無性系的苗高、地徑和生長量增量生長指標(biāo)均表現(xiàn)出下降的趨勢；各無性系根冠比和細胞膜透性指標(biāo)出現(xiàn)升高趨勢；而無性系的葉綠素含量不斷下降；各無性系的超氧化物歧化酶活性均不同程度地出現(xiàn)先上升后下降的趨勢；滲透調(diào)節(jié)物可溶性糖含量和脯氨酸含量均隨NaCl 脅迫濃度增加而增加。綜合評價得出接骨木無性系耐鹽程度由強到弱依次為XY-2、XY-3、XY-1、JY-1、PT-1、PT-3、PT-2。其中，無性系XY-2、XY-3 具有較強耐鹽性,可作為耐鹽接骨木無性系材料進行下一步研究。