姜穎 ，陳靜 ，董婧 ，吳麗娜 *

慢性呼吸系統(tǒng)疾病是我國居民的重要疾病負擔，2019年6月《柳葉刀》雜志刊文指出中國病死率前四位的疾病依次為腦卒中、缺血缺氧性腦病、肺癌和慢性阻塞性肺疾病[1]，其中包含兩種呼吸系統(tǒng)疾病。2019年10月鐘南山院士發(fā)文指出慢性呼吸系統(tǒng)疾病已成為我國嚴峻的公共衛(wèi)生問題之一，健康中國行動規(guī)劃(2019～2030年)中明確“實施慢性呼吸系統(tǒng)疾病防治行動”，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療應成為各級醫(yī)療機構防控慢性呼吸系統(tǒng)疾病的重要方向[2]。因此肺通氣功能早期診斷具有重要意義。肺功能檢查是目前肺通氣評價的主要檢查方法，但其對早期病變敏感度不高，不能對病灶準確定位。單光子發(fā)射計算機斷層顯像(single photon emission computed tomography，SPECT)雖能獲取肺功能信息，但SPECT作為放射性核素成像，其輻射不可忽視。磁共振成像的優(yōu)勢之一是無輻射，能夠進行多參數(shù)、多序列成像，可同時提供組織結構及功能信息等。常規(guī)MR因肺部氫質子密度低，水-氣交界面的磁敏感差異以及存在心動周期、呼吸運動偽影而在肺部應用受限[3]。隨著成像技術的進步，超短回波時間成像、超極化氣體成像等技術在呼吸系統(tǒng)疾病的應用已在國內外被廣泛報道，尤其新冠肺炎在全世界流行后，我國學者應用MR評估出，康復后的患者計算機斷層掃描(computerized tomography，CT)表現(xiàn)正常但其MR肺通氣成像卻檢測出肺氣-血交換功能減弱，這一發(fā)現(xiàn)是在CT評估預后解剖信息的基礎上對肺功能預后信息的重要補充[4]。盡管目前MR肺通氣成像方案仍存在對比劑獲取難度大、制備復雜和存儲運輸不便等局限。但毫無疑問，MR已逐漸成為當前肺CT成像的重要補充及肺功能成像的主要研究方法，對呼吸系統(tǒng)疾病的早期診斷具有重要意義[5-8]。

19F具有100%的天然豐度，核磁共振靈敏度較高，生物背景低等特點，其MR成像具有高信噪比[9]。全氟化碳是一種能提供高濃度19F核的化合物，具有易獲取、氧親和性高和化學性質穩(wěn)定等特點，并在新生兒呼吸窘迫的治療應用上獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局批準[10]。納米材料近年來被廣泛應用于MRI研究，通過控制納米顆粒大小能使其均勻沉積在肺深部組織的肺泡區(qū)，提高輸送效果。靈活的表面修飾和高表面積體積比有利于藥物負載，并能合成多功能、多模態(tài)的納米材料，在分子和細胞水平上提供高度敏感的成像信息和治療效果。這些特點使吸入納米顆粒結合肺深部組織的生物標志物成為可能，從而提高局部藥物濃度，放大分子信號。因此，納米粒子在呼吸道疾病的氣管內遞送成像和治療方面是極具吸引力的候選藥物[11,12]。經呼吸道霧化給藥更是在臨床中長期而廣泛的應用[13-15]。目前國內外鮮見霧化全氟化碳納米探針多核1H/19F磁共振(1H/19F magnetic resonance，1H/19F-MR)肺通氣成像方面的報道，本課題組先前的研究證明了，全氟化碳納米探針有良好的成像效果，并且經呼吸道遞送全氟化碳納米探針能提高肺癌1H/19F-MR圖像的質量[16-18]。因此在前期研究的基礎上，根據(jù)臨床肺通氣成像應用的重要需求，本研究探討基于霧化全氟化碳納米探針多核1H/19F-MR肺通氣成像的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠20只，鼠齡5～6周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。隨機分為霧化全氟化碳納米探針組和空氣組，每組10只，經不同處理后進行肺部1H/19F-MR掃描。本研究經過哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院動物倫理委員會批準(批準文號：2021-ZWLLSC-03)。

1.2 材料合成及表征

應用霧化全氟化碳納米探針進行MR肺通氣成像。該納米探針為一種負載羅丹明B磺酰基的光學和MR多模態(tài)成像探針，其合成方法參照發(fā)明專利及我課題組前期工作[16,19]。表面活性劑二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰甘油以及膽固醇以一定的摩爾配比混合，用有機溶劑將該混合物溶解并將其蒸干，過夜后用超聲震蕩的方式將其分散于水中得到表面活性劑混合物，將全氟化碳和甘油均勻分散于表面活性劑中，制成含有19F納米粒子的乳液，將未被有效包裹的成分透析去除制備成含19F納米粒子的磁共振納米成像探針，本研究所用的試劑為體積濃度20%的全氟正辛基溴烷納米探針(perfluoroctylbromide nanoprobe，PFOB NP)，氬氣密封并裝瓶，避光4℃保存。使用納米粒度及Zeta電位分析儀(Malvern Instruments Ltd，Malvern,UK)表征所合成納米探針的流體動力學直徑和Zeta電位。通過原子力顯微鏡(AFM，Bruker Dimension Icon)和透射電鏡(FEI，ThermoFisher，Waltham，MA)測量其均勻性。通過IVIS光學成像儀(Perkin Elmer，Waltham，MA)和 9.4 T MR 成像儀(BioSpec 94/20 USR，Bruker)獲得 PFOB NP樣品的光學和MR圖像。

1.3 MRI掃描

磁共振圖像均使用德國布魯克公司的9.4 T MR掃描儀(BioSpec 94/20 USR,Bruker)在1H/19F雙調諧線圈掃描下獲得。霧化全氟化碳納米探針組和空氣組分別行磁共振掃描。1H磁共振(1H magnetic resonance，1H-MR)掃描采用T1-RARE序列，參數(shù)為：TR819.257 ms，TE12ms，矩陣 256×256，F(xiàn)OV 38.4×38.4 mm2,層厚1.0 mm，層數(shù)15。19F磁共振(19F magnetic resonance，19F-MR)掃描使用的序列是m-cssi-序列和m-cssi-3D序列，其中m-cssi-序列參數(shù)為 ：TR 4587.061 ms，TE 156 ms，矩陣 64×64，F(xiàn)OV 38.4×38.4 mm2,層厚3.0 mm，層數(shù)5；m-cssi-3D序列的參數(shù)為：TR 4000 ms、TE 184.96 ms、矩陣60×60×40，層數(shù)1，層厚23.8 mm。在磁共振掃描的過程中連接生理監(jiān)測設備監(jiān)測小鼠呼吸速率和體溫。

1.4 圖片處理與數(shù)據(jù)分析

MRI的圖像處理及分析使用Image J。參照Ohno的方法[20]，將5周齡BALB/c鼠肺分為上、中、下三部分，避開圖像上可見的大血管影，在上、中、下肺野分別取5個ROI，測量各ROI的信號強度并取平均值。

1.5 統(tǒng)計分析

用于統(tǒng)計分析和繪制統(tǒng)計圖的軟件為Graphpad prism 6。所量化的數(shù)值以平均數(shù)±標準差表示。遞送霧化全氟化碳納米探針后肺各區(qū)域的19F信號強度差異、各劑量間、各時間點間的19F信號強度差異均使用單因素方差分析。在方差分析后進行的多重比較均采用Tukey法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 全氟化碳納米探針的表征

測得所制備的全氟化碳納米探針平均流體動力學直徑為(138.2±53.51)nm(圖 1A)，Zeta電位為(-14±4.94)mV(圖1B)，如圖1C和圖1E所示，透射電鏡和原子力顯微鏡結果顯示了全氟化碳納米探針尺寸高度均勻。不同濃度的全氟化碳納米探針樣品(圖1D)光學和MR圖像顯示了該探針具有良好的多模態(tài)成像性能(圖1F、1G)。。

圖1 全氟化碳納米探針的表征。A：全氟化碳納米探針的粒徑分布圖；B：全氟化碳納米探針的電位分布圖；C：全氟化碳納米探針的透射電鏡結果，比例尺為1.0 μm；D：全氟化碳納米探針的數(shù)碼圖片；E：全氟化碳納米探針的原子力顯微鏡結果，比例尺為5 μm；F：全氟化碳納米探針倍比稀釋后不同濃度樣品的體外光學成像；G：全氟化碳納米探針倍比稀釋后不同濃度樣品的體外1H/19F-MR成像Fig.1 Characterization of perfluorocarbon nanoprobes.A:The particle size distribution diagram of the perfluorocarbon nanoprobe.B:The potential distribution diagram of the perfluorocarbon nanoprobe.C:Transmission electron microscopy results of perfluorocarbon nanoprobes(scale bar:1.0 μm).D:Digital picture of perfluorocarbon nanoprobes.E:Atomic force microscopy results of perfluorocarbon nanoprobes(scale bar:5.0 μm).F:Optical imaging of samples with different concentrations after multiple dilution.G:In vitro1H/19F-MR imaging of perfluorocarbon nanoprobes at different concentrations after dilution.

2.2 霧化全氟化碳納米探針的活體1H/19F-MR肺通氣成像

為探索5周齡BALB/c鼠霧化全氟化碳納米探針多核1H/19F-MR肺通氣成像的合適劑量及其進行肺通氣成像的可行性。不同組實驗動物分別經呼吸道遞送 25 μL、37.5 μL、50 μL、62.5 μL、75 μL 的霧化全氟化碳納米探針后進行1H/19F-MR圖像采集。其中遞送25 μL時實驗動物肺內未見19F-MR信號，其余劑量均可見19F-MR信號增強，當經呼吸道遞送75 μL霧化全氟化碳納米探針時，小鼠雙肺各區(qū)域明顯增強(圖2A)。分別測量25 μL、37.5 μL、50 μL、62.5 μL、75 μL給藥劑量下的19F-MR信號強度，發(fā)現(xiàn)劑量為75 μL時19F-MR信號強度最高，并且不同劑量之間的19F-MR信號強度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(圖2B)?？紤]到研究肺通氣信息應保證全肺野成像，同時小鼠耐受性有限，應盡量選取能滿足全肺野成像要求的最低劑量作為實驗所用劑量。而上述劑量實驗中僅75 μL能實現(xiàn)全肺野成像，同時經呼吸道遞送該劑量的組別中小鼠無死亡。因此，本實驗后續(xù)MR成像所使用的劑量均為75 μL/只。

在經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針進行1H/19F-MR掃描后，肺各區(qū)域明顯增強，霧化全氟化碳納米探針1H/19F-MR成像能較好地描繪肺的整體解剖輪廓(圖2C)。在添加偽彩的19F三維磁共振(19F three dimensional magnetic resonance，19F3D MR)圖像(圖 2D)和19F 3D MR重建圖像(圖2E)上顯示肺各區(qū)域的19F信號強度并不相同，肺門附近的強化程度最高，其次是中肺野和上肺野，肺野內帶較肺野外帶的強化程度高。分別量化肺各區(qū)域的19F信號強度并進行統(tǒng)計分析(圖2G)，結果顯示肺各區(qū)域的19F信號強度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。其中上肺野和中肺野之間的19F信號強度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，上肺野和下肺野之間、中肺野和下肺野之間的19F信號強度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 小鼠遞送霧化全氟化碳納米探針后肺內的MR信號強度(n=3)Tab.1 MR signal intensity in the lungs of mice delivered with aerosolized perfluorocarbon nanoprobe(n=3)

研究經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針的肺內代謝時間，分別在0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h時間點進行1H/19F-MR成像，發(fā)現(xiàn)霧化全氟化碳納米探針進入肺內后，在48 h時間點的成像中未見強化(圖2F)。對上述各時間點19F-MR信號強度進行統(tǒng)計分析，結果顯示19F-MR增強信號自全氟化碳納米探針遞入至肺內后穩(wěn)定持續(xù)約4 h，在8 h檢測時間點19F-MR信號開始減弱，24 h顯著減弱，48 h信號減至背景噪聲水平(圖2H)。

圖2 經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針后所采集的1H/19F-MR圖像及19F信號強度統(tǒng)計圖。A：遞送不同劑量霧化全氟化碳納米探針時的1H/19F-MR圖像；B：各劑量MR圖像中所測得的19F信號強度統(tǒng)計圖；C：m-cssi-3D序列采集的19F 3D MR灰階圖像(從編號1至編號18的每幅圖是3D連續(xù)動態(tài)圖像的分解圖)；D：m-cssi-3D序列采集的19F 3D MR偽彩圖像；E：m-cssi-3D序列采集的19F 3D MR重建偽彩圖像；F：經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針后0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h的1H/19F-MR圖像；G：經呼吸道遞送75 μL霧化全氟化碳納米探針時，肺各區(qū)域的19F信號強度統(tǒng)計圖；H：各時間點1H/19F-MR圖像中19F信號強度統(tǒng)計圖Fig.2 1H/19F-MR images collected after delivering aerosolized perfluorocarbon nanoprobe through the respiratory tract and19F signal strength statistics chart.A:1H/19F-MR images when delivering different doses of atomized perfluorocarbon nanoprobe.B:Statistical graph of the19F signal intensity measured in the MR image of each dose.C:19F 3D MR grayscale image collected by m-cssi-3D sequence(each image from number 1 to number 18 is an exploded view of 3D continuous dynamic images).D:19F 3D MR pseudo-color image collected by m-cssi-3D sequence.E:19F 3D MR reconstructed pseudo-color images collected by m-cssi-3D sequence.F:1H/19F-MR images of 0 h,1 h,4 h,8 h,12 h,24 h,48 h after delivering the atomized perfluorocarbon nanoprobe through the respiratory tract.G:Statistical graph of19F signal intensity in each area of the lung when 75 μL aerosolized perfluorocarbon nanoprobe is delivered through the respiratory tract.H:Statistical graph of19F signal intensity in1H/19F-MR image at each time point.

2.3 組織水平實驗

2.3.1 肺組織熒光成像實驗

通過肺組織切片驗證霧化全氟化碳納米探針在肺組織的沉積，經呼吸道遞送全氟化碳納米探針后取小鼠離體肺組織制作成冰凍切片并進行熒光成像實驗，圖3A顯示經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針后，肺組織切片可以觀察到全氟化碳納米探針沉積。

2.3.2 霧化全氟化碳納米探針的生物安全性

納米探針的安全性是其生物醫(yī)學應用的關鍵，因此在經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針后，于48 h分別取肺、心、肝、脾、腎等組織進行H&E染色，結果顯示各組織未見明顯損傷和形態(tài)學改變(圖3C)。經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針后，對小鼠進行體質量監(jiān)測，結果顯示在應用霧化全氟化碳納米探針后，小鼠體質量無明顯變化(圖 3B)。

圖3 組織水平實驗結果。A：經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針后肺組織切片的熒光成像，其中紅色熒光為全氟化碳納米探針，藍色熒光為細胞核，比例尺為100 μm，放大倍數(shù)10×；B：對照組和經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針組的小鼠體重變化。C：經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針各主要器官H&E染色，放大倍數(shù)為20×Fig.3 Organizational level experimental results.A:Fluorescence imaging of lung tissue slices after delivery of aerosolized perfluorocarbon nanoprobes through the respiratory tract.The red fluorescence is PFOB NP.The blue fluorescence is nucleus.The scale bar is 100 μm,and the magnification power is 10×.B:Changes in body weight of mice in the control group and the group that delivered aerosolized perfluorocarbon nanoprobes through the respiratory tract.C:H&E staining of the main organs of aerosolized perfluorocarbon nanoprobes delivered through the respiratory tract.The magnification power is 20×.

3 討論

MR肺通氣成像通過成像探針隨呼吸系統(tǒng)內氣流運動所表現(xiàn)出的對比增強作用描繪肺部解剖結構的同時，利用增強信號反映肺局部氣流運動的信息。本研究中采用霧化的全氟化碳納米粒子作為成像探針，經呼吸道遞送后隨氣流運動。我們獲得了雙肺明顯增強的小鼠肺部1H/19F-MR圖像，這說明所用的成像探針能隨氣流經各級支氣管進入肺泡，從而在肺各區(qū)域廣泛分布。

3D磁共振成像是一種能全方位、多角度在體展示解剖、生理、病理信息的一種MR成像技術。本研究的3D MR成像中顯示，主支氣管、肺尖、肺底、肋膈角等處均見19F-MR信號增強，且肺各區(qū)域的強化程度不同，距離主支氣管最近的肺門附近強化程度最高，中肺野和上肺野強化較高，下肺野尤其是近肋膈角處強化程度明顯降低。量化肺各區(qū)域的19F-MR信號強度，發(fā)現(xiàn)肺各區(qū)域之間的信號強度存在差異，其中上肺野和中肺野之間的信號強度并無明顯差異(P＞0.05)，上肺野和下肺野之間、中肺野和下肺野之間的信號強度有顯著差異(P＜0.01)。產生這種信號差異的原因主要與呼吸系統(tǒng)解剖特點有關，即氣流由主支氣管進入肺內，隨各級支氣管到達肺泡，左右主支氣管為一級支氣管，分支為各肺葉支氣管，進入肺葉后分支成各肺段支氣管，直至依次再分支為小支氣管、細支氣管和終末細支氣管等，各級支氣管管徑粗細不均，由上一級至下一級逐漸變細，肺野內帶支氣管較肺野外帶支氣管管徑粗。因此生理情況下肺各區(qū)域的通氣率分布并不均勻[21]，其中左右主支氣管位于中肺野，因此該區(qū)域通氣率較其他區(qū)域高，霧化全氟化碳納米探針更容易隨氣流到達該處，進而19F信號強化最明顯，而近肋膈角處的下肺野外帶由于其所含支氣管分級較低，霧化全氟化碳納米探針沉積較少，導致19F信號強化程度相對較弱。這表明霧化全氟化碳納米探針不僅能使雙肺增強、描繪肺部解剖信息，還可以通過19F信號強度的分布反映肺通氣功能信息。在以往的研究中有學者利用霧化釓或氟化氣體肺MR成像反映生理狀態(tài)下的肺通氣情況，其結果與本實驗研究結果一致，即MR肺通氣成像能描繪對比劑在肺內的分布，MR信號能反映區(qū)域肺通氣信息，且肺各區(qū)域MR信號的強化程度有所差異[22,23]。因此，霧化全氟化碳納米探針多核1H/19F-MR肺通氣成像解決了肺部一直以來因解剖特點而MR應用受限的難題，為MR肺通氣成像提供了新的成像探針，同時也拓展了經呼吸道遞送納米探針肺部成像的研究方向，為后續(xù)該方向的深入研究奠定基礎。

在本研究中，肺組織切片熒光成像觀察到代表全氟化碳納米探針的紅色熒光，表明該給藥方案中，霧化全氟化碳納米探針能有效沉積于深層肺組織。H&E染色顯示各器官未見異常病理損傷。這表明該探針具有良好的生物安全性，為該成像方案進一步研究和臨床轉化提供了數(shù)據(jù)基礎。

本文也存在一定局限性，未深入研究該種給藥方案在生物體內微環(huán)境的情況，包括細胞和因子的防御性免疫反應、代謝途徑和機制等。因此，在后續(xù)研究中將單獨立題，充分而全面地研究所用納米探針經呼吸道遞送的代謝機制及安全性評價，為拓展該探針的研究內容和實現(xiàn)臨床轉化提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，經呼吸道遞送霧化全氟化碳納米探針多核1H/19F-MR肺通氣成像能反映健康小鼠肺部解剖結構和生理情況下的肺通氣信息，可以實現(xiàn)MR肺通氣成像，并且有望在呼吸系統(tǒng)疾病的早期影像診斷中發(fā)揮重要作用，是國際上基于霧化全氟化碳納米探針1H/19F-MR肺通氣成像可行性的罕見報道，為后續(xù)研究兼具精準診療功能和多模態(tài)肺通氣成像的全氟化碳納米探針奠定數(shù)據(jù)基礎。利用多核1H/19F-MR技術解決了單一氫質子MR肺成像的局限性難題，提出了新的MR肺通氣成像探針，豐富了MR肺通氣成像策略，對慢性呼吸系統(tǒng)疾病早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有重要意義。

作者利益沖突聲明：全部作者均聲明無利益沖突。