廖明星，潘瑞琪，艾承錦，李珊珊，周新穎

0 引 言

特發(fā)性肺纖維化系病因未明確組織病理以彌漫性肺泡炎癥、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂為特點(diǎn)，晚期呈明顯肺間質(zhì)纖維化改變的肺間質(zhì)疾病[1]。疾病最終導(dǎo)致有效肺通氣單位減少，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)呼吸衰竭，預(yù)后通常較差[2]。但該病早期無(wú)特異性表現(xiàn)，以進(jìn)行性加重呼吸困難為特點(diǎn)，部分伴肺動(dòng)脈高壓、發(fā)紺、右心功能不全，常規(guī)CT常呈現(xiàn)與普通間質(zhì)性肺炎相似征象，早期診斷困難[3]。以往對(duì)肺纖維化評(píng)定主要依賴(lài)組織病理學(xué)檢查，存在有創(chuàng)性，且受采樣部位影響大，存在一定的局限[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肺間質(zhì)纖維化病變過(guò)程中由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等共同參與，其誘導(dǎo)肺間質(zhì)慢性炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)沉積在肺纖維化發(fā)病中有關(guān)鍵作用[5]。涎液化糖鏈抗原6(krebs von den lungen-6，KL-6)系Ⅱ型肺泡細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞所分泌的黏蛋白樣糖蛋白。早期認(rèn)為KL-6異常上調(diào)與肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損密切相關(guān)[6]。不同原因所致肺部損傷病例均可見(jiàn)KL-6水平異常改變，且與肺部病變嚴(yán)重程度存在明顯關(guān)聯(lián)[7]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β被認(rèn)為系經(jīng)典致纖維化因子，參與TGF-β/Smads纖維性疾病信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，可引起膠原蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終誘發(fā)纖維化病變[8]。趨化因子13(chemotactic factor 13，CXCL13)主要由次級(jí)淋巴組織、淋巴結(jié)及濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)可趨化骨髓源性肝干細(xì)胞，與肝纖維化及肝硬化有關(guān)[9]。為探討特發(fā)性肺纖維化患者血清KL-6、TGF-β、CXCL13表達(dá)特點(diǎn)及其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，本研究評(píng)估三者單項(xiàng)及聯(lián)合預(yù)測(cè)肺纖維化效能，以期為肺纖維化早期診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象采集2017年1月-2019年10月我院收治的89例特發(fā)性肺纖維化患者作為纖維化組。入選標(biāo)準(zhǔn)：滿足特發(fā)性肺纖維化診斷臨床指南中特發(fā)性肺纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；無(wú)明確誘因，伴進(jìn)行性呼吸困難或無(wú)明顯癥狀；年齡>20歲，病程>3個(gè)月；雙肺聽(tīng)診可聞及Velcro啰音；胸部高分辨CT(high resolution CT，HRCT)見(jiàn)雙肺網(wǎng)狀病變；臨床資料完備。排除標(biāo)準(zhǔn)：已知各類(lèi)病因所致肺纖維化；近8周內(nèi)接受免疫抑制劑或激素類(lèi)藥物治療者；合并肺部其他病變或感染；患有嚴(yán)重肝腎功能不全、心腦血管疾病或精神障礙。選取同期來(lái)醫(yī)院體檢，且與特發(fā)性肺纖維年齡匹配的100例對(duì)象作為健康組。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)全身體檢證實(shí)身體健康、心肝腎肺功能正常；體檢當(dāng)日留存完整血樣。排除既往有肺纖維化病變史或其他肺部病變者。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào)：2017BL-001)，所有受試均知情同意。2組性別、年齡、吸煙情況、身體質(zhì)量指數(shù)等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 入組受試者臨床資料對(duì)比Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

1.2方法

1.2.1 血清KL-6、TGF-β、CXCL-13水平測(cè)定取所有研究對(duì)象留存血樣標(biāo)本3～5 mL。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清KL-6、TGF-β、CXCL13水平。其中KL-6雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒由日本FuJi瑞必歐株式會(huì)社提供；TGF-β雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒由美國(guó)R&D公司提供；人肺部活化趨化因子13酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cusabio公司。嚴(yán)格按試劑使用說(shuō)明操作，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?zhuān)眉兓疜L-6/TGF-β/CXCL-13抗體包被微孔板，制成固相抗體，包被單抗微孔內(nèi)添加KL-6/TGF-β/CXCL13表面抗原，封板膜封板，37 ℃溫育30 min，20倍稀釋?zhuān)瑮壋后w，甩干并重復(fù)以上操作5次。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)抗體，形成抗體-抗原-抗酶標(biāo)復(fù)合物，溫育后徹底洗滌，加入顯色劑37 ℃避光顯色15 min，加入終止液終止染色，上iMark型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值，軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本KL-6、TGF-β、CXCL13濃度。

1.2.2肺功能檢查入院時(shí)均行肺功能檢查，采用德國(guó)耶格Master Screen Pneumo肺功能，測(cè)定所有對(duì)象肺總量(total lung capacity，TLC)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(forced expiratory volume in one second/predict value，F(xiàn)EV1%pred)，并進(jìn)行彌散功能檢查，記錄一氧化碳彌散量占預(yù)計(jì)值百分比(carbon monoxide diffusing capacity/predict value，DLCO%pred)。

1.2.3HRCT檢查采用美國(guó)GE公司Light Speed VCT 64排螺旋CT掃描儀進(jìn)行HRCT檢查，仰臥，先行平掃，呼氣末進(jìn)行，自肺尖掃描至膈頂，掃描層厚1.25 mm、準(zhǔn)直1.5 mm、層間距10 mm、管電流250 mA、電壓120 kV、矩陣512×512。完畢后行高空間分辨率重建，視野45 mm×45 mm。部分加作俯臥位掃描，肺窗(窗寬2000 HU、窗位-550 HU)、縱膈窗(窗寬450 HU、窗位55 HU)拍攝CT片，觀察肺間質(zhì)病變情況。以主動(dòng)脈弓、右下肺靜脈為界限，分為左右上、中、下3個(gè)肺區(qū)，觀察各個(gè)肺區(qū)病變及受累情況，具體肺纖維化量化征象參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 組間血清KL-6、TGF-β、CXCL13水平比較纖維化組血清KL-6、TGF-β、CXCL13水平顯著高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清KL-6、TGF-β、CXCL13水平比較Table 2 Comparison of serum KL-6,TGF-β and CXCL13 levels in each group

2.2組間肺功能參數(shù)及HRCT評(píng)分比較纖維化組肺功能參數(shù)TLC、FVC、FEV1%pred、DLCO%pred低于健康組，HRCT評(píng)分高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組肺功能參數(shù)、HRCT評(píng)分比較Table 3 Comparison of lung function parameters and HRCT scores in each group

2.3不同HRCT評(píng)分患者血清KL-6、TGF-β、CXCL13水平比較89例患者HRCT評(píng)分≤4分59例，>4分30例；HRCT評(píng)分≤4分特異性肺纖維化患者血清KL-6、TGF-β、CXCL13水平顯著低于>4分患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同HRCT評(píng)分患者KL-6、TGF-β、CXCL13水平比較Table 4 Comparison of KL-6,TGF-β and CXCL13 levels in patients with different HRCT scores relatively

2.4特發(fā)性肺纖維化患者血清KL-6、TGF-β、CXCL13與肺功能參數(shù)、HRCT評(píng)分的關(guān)系KL-6、TGF-β、CXCL13與FVC、FEV1%pred、DLCO%pred呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與HRCT評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。KL-6、TGF-β與TLC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 特發(fā)性肺纖維化患者血清KL-6、TGF-β、CXCL13與肺功能參數(shù)、HRCT評(píng)分的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficients of serum KL-6,TGF-β,CXCL13 with pulmonary function parameters and HRCT score in patients with idiopathic pulmonary fibrosis

2.5血清KL-6、TGF-β、CXCL13預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生效能血清KL-6、TGF-β、CXCL13對(duì)于特發(fā)性肺纖維化均具有較高的預(yù)測(cè)效能。其中TGF-β效能最高，其次為KL-6，但三者聯(lián)合預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)。見(jiàn)表6，圖1。

表6 血清KL-6、TGF-β、CXCL13預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生的ROC分析Table 6 Serum KL-6,TGF-β and CXCL13 predict the occurrence of idiopathic pulmonary fibrosis the ROC analysis of the software

圖1 血清KL-6、TGF-β、CXCL13及其聯(lián)合預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生的ROC曲線Figure 1 Serum KL-6,TGF-β,CXCL13 and their combined prediction of idiopathic pulmonary fibrosis ROC curve of Dimensionalization

3 討 論

特發(fā)性肺纖維化病理以肺組織成纖維細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特點(diǎn)，最終可引起不可逆肺組織結(jié)構(gòu)破壞及畸變，降低肺順應(yīng)性，導(dǎo)致肺容量減少，肺彌散功能下降，肺通氣能力降低，造成肺功能異?；騿适12]。肺纖維化病變過(guò)程中受損上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞適當(dāng)大量促纖維細(xì)胞因子，誘導(dǎo)膠原生成，引起不可逆肺組織受損[13]。

KL-6是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與纖維化病變密切相關(guān)的糖蛋白抗原，屬人類(lèi)黏蛋白家族成員，正常條件下主要分布于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞與細(xì)支氣管上皮細(xì)胞[14]。當(dāng)以上細(xì)胞功能受損時(shí)，KL-6分泌增多，從上皮細(xì)胞脫落進(jìn)入肺泡與外周血循環(huán)，導(dǎo)致血KL-6濃度上調(diào)[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)，KL-6與結(jié)締組織病肺間質(zhì)病變程度有關(guān)，隨病變進(jìn)展而濃度上升。也有研究顯示，放射性肺炎、肺結(jié)節(jié)病等多種間質(zhì)性肺疾病均伴KL-6表達(dá)上調(diào)[17-18]。本研究亦證實(shí)KL-6與特發(fā)性肺纖維化有關(guān)，特發(fā)性肺纖維患者血清KL-6濃度明顯高于正常健康人群，同時(shí)隨HRCT顯示肺纖維化程度、受累范圍的增加，KL-6濃度逐漸上升，證實(shí)KL-6可能參與特發(fā)性肺纖維化病變發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程?？紤]在正常組織修復(fù)過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞發(fā)揮重要作用，其前體細(xì)胞活化形成肌成纖維細(xì)胞，促使細(xì)胞外基質(zhì)合成特征與平滑肌細(xì)胞特有細(xì)胞骨架特征結(jié)合，調(diào)節(jié)結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，促成表型反應(yīng)，以恢復(fù)組織完整性[19]；但出現(xiàn)肺纖維化病變時(shí)，肌成纖維細(xì)胞活化加快，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量釋放，促進(jìn)組織炎性浸潤(rùn)及新生血管生成，促進(jìn)致纖維細(xì)胞因子生成，引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞膠原蛋白沉積及細(xì)胞外間質(zhì)沉積，破壞Ⅱ型肺泡細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致大量KL-6釋放、脫落、進(jìn)入外周血液循環(huán)，加重肺纖維化病變[20]。

TGF-β系目前已證實(shí)致纖維作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，參與成纖維細(xì)胞組織、間質(zhì)細(xì)胞異常增殖等病理過(guò)程[21]。毛娜等[22]以TGF-β處理肺成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，TGF-β處理組肺成纖維細(xì)胞增殖明顯。也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β調(diào)控重要致纖維化信號(hào)通路TGF-β/Smads，其濃度異常上調(diào)，可活化該通路下游Smads蛋白，引起細(xì)胞形態(tài)改變，減少上皮細(xì)胞間質(zhì)連接，促進(jìn)纖維化病變進(jìn)展[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化患者血清TGF-β濃度明顯高于正常健康組，支撐以上觀點(diǎn)，表明TGF-β可能為參與特發(fā)性肺纖維化發(fā)病的關(guān)鍵因子。且隨纖維化組肺纖維化HRCT病變程度的提升，患者TGF-β水平逐漸上升，表明TGF-β濃度與肺纖維化病變程度密切相關(guān)?？紤]TGF-β承擔(dān)細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)等功能，在細(xì)胞外機(jī)基質(zhì)合成及損傷修復(fù)方面有重要作用，大量TGF-β釋放可通過(guò)影響Smads蛋白依賴(lài)與非依賴(lài)性途徑，磷酸化Smads蛋白，促使其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞連接受損，上皮細(xì)胞黏附減弱，引起成纖維細(xì)胞增殖，大量膠原蛋白釋放并沉積，導(dǎo)致纖維化病變[24]。且其病變程度與TGF-β濃度呈明顯正相關(guān)，TGF-β濃度越高，其所誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖越明顯，肺上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化更明顯，纖維化病變程度越高[25]。

CXCL13屬趨化因子配體成員，主要由次級(jí)淋巴組織、濾泡狀樹(shù)突細(xì)胞及淋巴結(jié)分泌，在趨化B淋巴細(xì)胞歸巢至淋巴濾泡內(nèi)有重要作用[26]。前期已證實(shí)CXCL13可促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生，可促進(jìn)結(jié)腸癌、前列腺癌發(fā)病、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[27-28]。近年來(lái)也有報(bào)道顯示，CXCL13參與肝纖維化及肝硬化發(fā)病過(guò)程，且與肝功能受損程度密切相關(guān)[29]。但對(duì)其在肺纖維化中是否存在類(lèi)似作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化患者血清CXCL13水平較正常人高，且隨肺纖維化病變程度的上升，CXCL13水平上升，提示CXCL13可誘導(dǎo)肺組織纖維化病變及進(jìn)展。分析機(jī)制可能為：CXCL13可促使上皮間質(zhì)細(xì)胞遷移，參與組織損傷修復(fù)過(guò)程，可趨化炎癥因子、B淋巴細(xì)胞因子于肺組織，引起上皮間質(zhì)纖維化病變，促進(jìn)前體間充質(zhì)細(xì)胞分化為活化成纖維細(xì)胞，并與促纖維化因子協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白沉積，導(dǎo)致肺纖維化病變[30]。本研究還發(fā)現(xiàn)，KL-6、TGF-β、CXCL13均與特發(fā)性肺纖維化患者肺功能改變、肺組織纖維化病變程度密切相關(guān)，隨以上各參數(shù)濃度的上升，肺功能逐漸降低，肺纖維化程度上升，突出表現(xiàn)為肺通氣、彌散功能下降，這與肺纖維化病變特點(diǎn)存在一致性，提示肺纖維病變通常伴肺順應(yīng)性降低，通氣功能減弱，肺組織彈性降低，整體肺功能減弱；且隨以上致纖維化相關(guān)因子濃度上升，肺纖維化病變加重，肺功能受損更嚴(yán)重。此外，本研究通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，三者預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化病變發(fā)生均有較高的效能，尤其TGF-β預(yù)測(cè)肺纖維化病變效能最高，這與范亞麗等[31]研究結(jié)論相似，推測(cè)TGF-β與特發(fā)性肺纖維化發(fā)生及肺功能受損程度有關(guān)。且ROC分析發(fā)現(xiàn)，三者聯(lián)合預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化效能優(yōu)于單獨(dú)指標(biāo)，提示三者聯(lián)合評(píng)估可提高特發(fā)性肺纖維化診斷效能，故認(rèn)為早期聯(lián)合篩查T(mén)GF-β、KL-6、CXCL13可提高特發(fā)性肺纖維化檢出率，有望作為早期特發(fā)性肺纖維化診斷的依據(jù)，對(duì)單獨(dú)篩查不能明確肺纖維化時(shí)，可考慮聯(lián)合其他兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢查，以提高篩查準(zhǔn)確性。

綜上，特發(fā)性肺纖維化患者伴明顯血清KL-6、TGF-β、CXCL13異常上調(diào)，且與肺纖維化病情進(jìn)展有關(guān)，三者聯(lián)合篩查對(duì)特發(fā)性肺纖維化早期診斷綜合效能較高。但本研究樣本數(shù)量有限，且尚未明確特發(fā)性肺纖維化患者KL-6、TGF-β、CXCL13三者表達(dá)的相關(guān)性，存在一定的局限性，同時(shí)對(duì)本文對(duì)三者表達(dá)水平改變與肺纖維化病情進(jìn)展的關(guān)系尚未闡明，后續(xù)需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本數(shù)量論證本研究結(jié)論，并探究以上各參數(shù)相互影響機(jī)制，明確三者與肺纖維病情變化及進(jìn)展的關(guān)系，以期為肺纖維化防治提供證據(jù)。