羅 芳，賴石鳳，陳 悅，羅 丹，彭文慧，汪保國，劉 維

0 引 言

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的通過呼吸道傳播的慢性傳染病[1]。2016年全球估算有1040萬例新發(fā)結(jié)核病患者，約有170萬人死于結(jié)核病[2]。而我國每年發(fā)病患者約為90萬例，位居全球第三位，且隨著異煙肼耐藥結(jié)核菌的增加，肺結(jié)核患者治療難度加大，中國仍然是全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[3-4]。感染結(jié)核桿菌者僅有5%～15%發(fā)展成為結(jié)核病患者[5]，提示肺結(jié)核的發(fā)病不僅與環(huán)境因素相關(guān)，還與機(jī)體免疫能力相關(guān)。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，是機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌最重要的免疫因素之一，Th1和Th2型效應(yīng)細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)則為其中一種[6]。IL-10的高度表達(dá)可抑制細(xì)胞介導(dǎo)的抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫反應(yīng)，增加機(jī)體對(duì)結(jié)核分支桿菌的易感性。血漿中IL-10的含量與該基因rs1800896位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性有關(guān)[7]。目前的研究主要關(guān)注傳統(tǒng)環(huán)境因素、宿主遺傳易感因素在結(jié)核病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中的單獨(dú)作用，而有關(guān)兩者交互作用是否會(huì)對(duì)肺結(jié)核發(fā)病造成一定影響的研究報(bào)道較少，因此本研究將進(jìn)一步分析IL-10 rs1800896位點(diǎn)基因多態(tài)性和吸煙在肺結(jié)核發(fā)病過程中的交互作用，為有效控制肺結(jié)核的發(fā)生和流行提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018至2019年廣東省多個(gè)結(jié)核病防治單位107例肺結(jié)核確診患者，作為肺結(jié)核組。納入標(biāo)準(zhǔn)：參考《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南》，結(jié)合病史、臨床癥狀、CT/X線檢查以及痰涂片、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：肺炎、肺癌和塵肺等具有結(jié)核相似病癥者，糖尿病、艾滋病以及腫瘤癌癥，長期使用激素等免疫能力低下者。另從同期體檢的健康人群或當(dāng)?shù)氐慕】稻用裰羞x取健康對(duì)照118例，作為對(duì)照組。本研究獲得廣東藥科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：20180222)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2調(diào)查方法

1.2.1 問卷設(shè)計(jì)與調(diào)查通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料并結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)際情況自行編制問卷，再根據(jù)專家意見對(duì)問卷進(jìn)行修改調(diào)整，預(yù)調(diào)查后投入使用。問卷信度測(cè)量采用重測(cè)信度法，信度系數(shù)為0.72。專業(yè)調(diào)查員與研究對(duì)象進(jìn)行面對(duì)面流行病學(xué)問卷調(diào)查，調(diào)查問卷內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、生活環(huán)境、個(gè)人行為因素等。吸煙：每天1 支及以上，連續(xù)吸煙3個(gè)月及以上。飲酒：每天飲酒50 g及以上，連續(xù)飲酒6個(gè)月及以上。

1.2.2方法利用一次性真空抗凝管采集研究對(duì)象靜脈血5 mL，于-80 ℃冰箱保存，整個(gè)過程無菌操作，避免血樣污染。廣東省分子探針與生物醫(yī)學(xué)影像工程技術(shù)中心完成以下步驟：①DNA的提?。喝? mL外周靜脈血于EDTA抗凝管中，采用北京天根生化科技有限公司提供的TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提??；②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：NCBI中找到相應(yīng)的參考序列，使用軟件Primer Premier 3.0進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，IL-10基因rs1800896位點(diǎn)的上游引物序列為5′-GTGAAGGCTCAATCAAAGG-3′，下游引物序列為5′-TGGTTTCCTCACCCTACTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為429bp。以提取的基因組DNA為模板，將目的基因上游和下游引物加水溶解、稀釋，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，再按照Millipore公司96純化板操作流程操作進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，最后利用Sanger法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。

1.3質(zhì)量控制采用面對(duì)面的方式進(jìn)行問卷調(diào)查，讓患者自行回答，不能回答者則由其家屬代答。調(diào)查結(jié)束后對(duì)重要的信息進(jìn)行再次核實(shí)，確保信息真實(shí)可靠。采用Epidata3.1 軟件雙人平行錄入數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，建立數(shù)據(jù)庫用以保存錄入的數(shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示，組間比較采用2檢驗(yàn)，利用2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)Hardy-Weinberg進(jìn)行遺傳平衡(HWE)定律驗(yàn)證[8]，以判斷樣本人群是否來自于同一群體。使用單因素Logistic回歸模型分析環(huán)境因素、基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感的關(guān)聯(lián)，多因素非條件Logistic回歸模型納入乘積項(xiàng)法計(jì)算兩者相乘交互作用，用叉生分析法計(jì)算相加交互作用。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 一般人口學(xué)特征肺結(jié)核組平均年齡為(42.10±16.87)歲，男72例，女35例；對(duì)照組平均年齡為(43.18±14.96)歲，男67例，女51例。均為漢族人。肺結(jié)核組和對(duì)照組的年齡、性別、婚姻狀況和文化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2肺結(jié)核發(fā)病危險(xiǎn)因素的單因素分析吸煙在肺結(jié)核組和對(duì)照組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，肺結(jié)核組的吸煙暴露率是對(duì)照組的2.74倍(OR=2.74 ,95%CI=1.57～4.78)，室內(nèi)采光、室內(nèi)通風(fēng)、工作環(huán)境粉塵以及飲酒在肺結(jié)核組和對(duì)照組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 肺結(jié)核患者發(fā)病危險(xiǎn)因素的單因素分析[n(%)]Table 1 Single factor analysis of tuberculosis risk factors n (%)

2.3肺結(jié)核發(fā)病危險(xiǎn)因素的多因素分析采用多因素Logistic回歸模型進(jìn)行分析，在調(diào)整了年齡、性別、婚姻狀況、文化程度 4個(gè)因素后結(jié)果顯示，肺結(jié)核組的吸煙暴露率是對(duì)照組的3.03倍(OR=3.03，95%CI：1.45～6.33)，吸煙是肺結(jié)核的患病風(fēng)險(xiǎn)因素。見表2。

表2 肺結(jié)核發(fā)病危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析結(jié)果Table 2 Results of multivariate Logistic regression analysis of tuberculosis risk factors

2.4IL-10基因的遺傳多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系

2.4.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)采用2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)對(duì)IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)的AA、AG、GG基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗(yàn)證，肺結(jié)核組和對(duì)照組的基因型分布達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)，具有良好的群體代表性。見表3。

表3 IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg檢驗(yàn)Table 3 Hardy-Weinberg test of rs1800896 genotype of IL-10

2.4.2IL-10 rs1800896位點(diǎn)基因型與等位基因在不同組中的分布IL-10基因rs1800896位點(diǎn)的AA、AG、GG基因型在肺結(jié)核組、對(duì)照組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)；A、G等位基因在肺結(jié)核組和對(duì)照組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。見表4。

表4 IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)基因型與等位基因在肺結(jié)核組和對(duì)照組的分布[n(%)]Table 4 Distribution of the rs1800896 polymorphism of IL-10 in patients and controls n(%)

2.4.3IL-10 rs1800896位點(diǎn)不同遺傳模型與肺結(jié)核易感性的關(guān)系超顯性模型(AA+GGvsAG )中，肺結(jié)核組的AG基因型存在率為對(duì)照組的3.69倍，攜帶AG基因型者肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)增加；顯性模型(AG+GGvsAA)中，肺結(jié)核組的AG+GG基因型存在率為對(duì)照組的3.45倍，攜帶AG+GG基因型者肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)增加；等位基因模型(AvsG)中，肺結(jié)核組的G等位基因存在率為對(duì)照組的2.83倍，攜帶G等位基因型者肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)增加；而共顯性模型(AAvsAGvsGG)及隱性模型(GGvsAA+AG)，2組間基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)不同遺傳模型與肺結(jié)核易感性的關(guān)系分析[n(%)]Table 5 Correlation between different genetic models of the rs1800896 polymorphism of IL-10 and the susceptibility of TB n (%)

2.5IL-10基因與吸煙的交互作用對(duì)肺結(jié)核發(fā)病的影響

2.5.1 IL-10基因與吸煙的相乘交互作用對(duì)肺結(jié)核發(fā)病的影響單因素分析發(fā)現(xiàn)，吸煙、超顯性模型(AA+GGvsAG )中的AG基因型、顯性模型(AG + GGvsAA)中的AG + GG基因型在肺結(jié)核組中的暴露率高于對(duì)照組。IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)超顯性模型中的AG基因型與吸煙、顯性模型中的AG+GG基因型與吸煙的相乘交互作用項(xiàng)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明IL-10基因與吸煙在肺結(jié)核的發(fā)病過程中無相乘交互作用。見表6。

表6 IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)與吸煙的相乘交互作用分析結(jié)果Table 6 Analysis of the multiplied interaction between rs1800896 polymorphism of IL-10 and smoking

2.5.2IL-10基因與吸煙的相加交互作用對(duì)肺結(jié)核發(fā)病的影響IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)與吸煙的叉生分析結(jié)果顯示：在超顯性模型中，攜帶AG基因型且吸煙者的肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶AG基因型且不吸煙的11.05倍，AG基因型和吸煙同時(shí)存在的OR值明顯大于AG基因型和吸煙單獨(dú)存在時(shí)的OR值之和；在顯性模型中，攜帶AG+GG基因型且吸煙者的肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶AG+GG基因型且不吸煙的11.16倍。表明超顯性模型中的AG基因型與吸煙、顯性模型中的AG+GG基因型與吸煙在肺結(jié)核的發(fā)病過程中存在一定的相加交互作用。見表7。

表7 IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)與吸煙的叉生分析結(jié)果Table 7 Cross analysis of rs1800896 polymorphism of IL-10 and smoking

3 討 論

肺結(jié)核的發(fā)病受環(huán)境因素和宿主因素的共同影響，遺傳背景在肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展過程起著重要作用[9]。近年來，個(gè)體遺傳與肺結(jié)核易感性之間的關(guān)系已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[10]，但有關(guān)兩者在肺結(jié)核發(fā)病過程中是否產(chǎn)生交互作用的研究目前尚較少報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示吸煙可使肺結(jié)核的患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.03倍，有研究表明在控制了一系列的潛在混雜因素之后，吸煙仍然是導(dǎo)致肺結(jié)核的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11-12]，這與本研究所得結(jié)果一致。

IL-10可通過抑制和終止炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答以增加宿主對(duì)結(jié)核分支桿菌的易感性[13-14]。IL-10基因rs1800896位點(diǎn)存在著G→A、C→T/C→A的堿基變換，堿基的變換影響機(jī)體合成IL-10的能力，其中G等位基因與IL-10高產(chǎn)量相關(guān)，而A等位基因則與IL-10低產(chǎn)量相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，在超顯性遺傳模型(AA+GGvsAG )中，AG基因型肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)是AA+GG基因型的3.60倍，攜帶AG基因型者對(duì)肺結(jié)核更易感；在顯性遺傳模型(AG+GGvsAA)中，AA基因型肺結(jié)核的患病風(fēng)險(xiǎn)僅為AG+GG基因型的0.3倍，與陳悅等[15]的家系病例對(duì)照研究結(jié)果一致，提示攜帶AA基因型是肺結(jié)核易感的保護(hù)因素之一。肺結(jié)核組中的G等位基因頻率要高于對(duì)照組，G等位基因攜帶者肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)相比于A等位基因攜帶者增加了1.83倍，這與Ates等[16]和Oral等[17]的研究發(fā)現(xiàn)A到G的突變使個(gè)體肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上調(diào)是一致的，表明IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)的多態(tài)性與肺結(jié)核易感性有一定的關(guān)聯(lián)。該基因位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)于預(yù)測(cè)某些人群的結(jié)核病易感傾向以及提供藥物新靶點(diǎn)具有著重要意義[18]。

結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中存在復(fù)雜的基因-環(huán)境交互作用。本研究對(duì)IL-10基因rs1800896位點(diǎn)的超顯性遺傳模型、顯性遺傳模型與吸煙的相乘及相加交互作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IL-10基因與吸煙在肺結(jié)核的發(fā)病過程中未顯示出相乘交互作用，叉生分析結(jié)果顯示在超顯性模型中，攜帶AG基因型又吸煙者的肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶AG基因型且不吸煙的13.47(1.45～12.09)倍。在顯性模型中，攜帶AG+GG基因型且吸煙者的患病風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶AG+GG基因型且不吸煙的11.16倍(OR=11.16 95%CI=1.30～95.75)。表明IL-10基因 rs1800896位點(diǎn)AG及GG基因型與吸煙在肺結(jié)核發(fā)病過程中存在一定的相加交互作用，兩者同時(shí)存在會(huì)使肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，基因的分型聯(lián)合吸煙情況可用于早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核高風(fēng)險(xiǎn)人群，為肺結(jié)核的防治工作提供重要依據(jù)。

因此，吸煙可增加肺結(jié)核的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，IL-10 rs1800896位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與漢族人群肺結(jié)核易感性相關(guān)。IL-10 rs1800896位點(diǎn)基因多態(tài)性與吸煙在肺結(jié)核發(fā)病過程中未顯示出相乘交互作用，但存在一定的相加交互作用。本課題研究仍在繼續(xù)，未來研究將在樣本量進(jìn)一步擴(kuò)大的基礎(chǔ)上繼續(xù)深入探討相乘交互作用對(duì)肺結(jié)核發(fā)病的影響。