安學院，丁艷潔，李思源，李 軍，常子濤

0 引 言

糖尿病是一種由于胰島素分泌障礙和(或)胰島素抵抗而引起的慢性代謝性疾病[1]，其發(fā)病率居高不下[2]，根據國際糖尿病聯合會,2015估計有4.15億人年齡在20～79歲糖尿病患者,因糖尿病而導致500萬人死亡,全球因糖尿病引起的健康總支出約為6730億美元。到2040年，預計20～79歲的糖尿病患者人數將增至6.42億人[3]。無論1型還是2型糖尿病的發(fā)病都與胰島素分泌異常有關[1,4]。β細胞分泌胰島素的過程受到各種供能物質、激素、多肽和神經遞質類等的調控[5]，如肝細胞生長因子、胰升血糖素、胰升血糖素樣生長因子等。熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術是一種非輻射的能量轉移，可以定時、定量、定位、動態(tài)地觀察活細胞內蛋白質與蛋白質之間的相互作用[6],FRET具有敏銳度高，檢測快捷，無生物毒性等優(yōu)點[7]，在國內外得到廣泛應用。本課題組前期研究發(fā)現，胰升血糖素在不同葡萄糖濃度下，均可刺激胰島β細胞分泌胰島素[8-10]。本研究通過探討MIN6細胞在不同濃度葡萄糖及胰升血糖素干預下對第二信使蛋白激酶A(protein kinase A ,PKA)的作用，及對胰島素分泌的影響，以及添加PKA的刺激劑異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)后，MIN6細胞分泌胰島素的變化，為研究糖尿病的發(fā)病機理和靶向治療藥物的開發(fā)提供新的實驗室證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料小鼠來源的胰島β細胞瘤株MIN6細胞購自上海拜力生物科技有限公司，PKA的DNA質粒AKR源于John Hopkins University，胎牛血清、β-巰基乙醇、1640培養(yǎng)基粉末購于 GIBCO公司，L-谷氨酰胺、0.25% EDTA-胰蛋白酶液、胰高血糖素粉末購于Sigma公司，青-鏈霉素液購于北京索萊寶公司，小鼠胰島素-ELISA試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司，質粒大提試劑盒購于QIAGEN公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)MIN6細胞在37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換一次培養(yǎng)基，在細胞生長至80%密度時傳代，留取一些細胞置于-80 ℃冰箱或液氮中保存。

1.2.2實驗處理將MIN6細胞分別用不同濃度的胰升血糖素(0、500、1000 ng/L)和葡萄糖(0、2.8、16.7 mmol/L)處理，并加入ISO采用ELISA檢測MIN6細胞內胰島素水平。

1.2.3FRET測細胞內PKA水平將轉染醛酮還原酶48 h后的MIN6細胞換液，加入0.5 mL Krebs液，放在激光共聚焦顯微鏡下，定位單個細胞視野后換用油鏡觀察，設置激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍(CFP的激發(fā)波長是458 nm，發(fā)射波長是475～525 nm；YFP的激發(fā)波長是514 nm，發(fā)射波長是530～600 nm)，掃描時間設置為25 s/次，采集圖像。

1.2.4ELISA測細胞內胰島素水平MIN6細胞饑餓處理后，分別配制不同濃度葡萄糖和胰升血糖素以及準備ISO，收集上清液，并通過胰島素-ELISA試劑盒檢測每組的胰島素含量。

2 結 果

2.1 各組MIN6細胞內PKA水平的比較葡萄糖濃度2.8 、16.7 mmol/L時，500 ng/L 胰升血糖素(ISO+)、1000 ng/L (ISO-)的PKA表達水平較500 ng/L胰升血糖素(ISO-)明顯升高(P<0.05)；1000 ng/L胰升血糖素(ISO+)的PKA表達水平較500 ng/L 胰升血糖素(ISO+)、1000 ng/L (ISO-)明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 添加ISO前后不同葡萄糖濃度及胰升血糖素下PKA水平的比較Table 1 Comparison of the average ratio of CFP/YFP in different groups

2.2各組MIN6細胞內胰島素增量的比較0 mmol/L 葡萄糖時，1000 ng/L 胰升血糖素的胰島素增量較0 ng/L 胰升血糖素明顯升高(P<0.05)。2.8、16.7 mmol/L 葡萄糖時，500 ng/L 胰升血糖素和1000 ng/L 胰升血糖素的胰島素增量較0 ng/L 胰升血糖素明顯升高(P<0.05)。16.7 mmol/L葡萄糖時，1000 ng/L胰升血糖素的胰島素增量較500 ng/L胰升血糖素明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 添加ISO后胰島素增量的比較Table 2 Comparison of insulin increment in different groups before and after adding ISO

2.3細胞上清液的胰島素含量與PKA的相關性添加ISO前后，細胞上清液的胰島素含量與PKA均呈正相關(r=0.810、0.791，P<0.05)。見圖1。

a：無ISO；b:添加ISO后圖1 PKA與胰島素的相關性散點圖Figure 1 Correlation scatter diagram of PKA and Ins with ISO

3 討 論

2型糖尿病的發(fā)病機制相當復雜，主要表現為漸進性的β細胞功能障礙和和胰島素抵抗性。此外，其他病理生理異常如腎內葡萄糖重吸收增加、腸促胰島素作用減弱等也被發(fā)現與高血糖有關[11]。因此，降低血糖是糖尿病治療的重心，而胰島素是人體內降低血糖的主要激素。有研究表明葡萄糖是胰島素分泌的主要刺激劑，有調節(jié)胰島素分泌的作用，本課題組前期研究發(fā)現，胰升血糖素對胰島素的分泌有促進作用[12-13]。胰升血糖素可能通過旁分泌作用直接到達臨近的β細胞，也可能先與細胞膜上的胰升血糖素樣受體結合，使ATP在腺苷酸環(huán)化酶的作用下環(huán)化為cAMP，激活下游的PKA,從而調節(jié)胰島素的分泌，即通過cAMP-PKA第二信號途徑實現[14-17]。因此，PKA可能在胰升血糖素參與調控胰島素分泌中起重要作用，但其影響機制尚不十分清楚。

本研究使用 FRET 技術實時定量檢測活細胞內 PKA 的水平，結果顯示胰高血糖素有隨其濃度的增高而提高細胞內PKA水平的變化趨勢，而這種趨勢也隨著葡萄糖濃度的遞增而更加明顯，可見其具有葡萄糖依賴性；添加ISO后，隨著胰高血糖素濃度的增高，細胞內PKA水平的升高趨勢也更加明顯。使用 ELISA 檢測胰島素水平，用添加ISO后的胰島素水平減未添加ISO時的胰島素水平，結果顯示胰升血糖素有隨其濃度的增高而提高細胞內胰島素水平的變化趨勢。PKA含量與胰島素分泌量呈正相關關系，提示不同濃度的胰升血糖素干預可使不同葡萄糖水平的細胞上清液中的胰島素含量升高的機制可能與PKA有關。

綜上所述，本研究提示，胰升血糖素可能以濃度梯度遞增的方式上調MIN6細胞內PKA的水平從而促進MIN6細胞胰島素的分泌，添加PKA的刺激劑ISO后，該趨勢更加明顯，且這種作用具有葡萄糖依賴性。因此，進一步研究胰升血糖素在胰島素分泌中的機制，可以為糖尿病靶向藥物的開發(fā)提供實驗室依據。