趙 銳，朱 悅，陶 琳，單 軍

0 引 言

糖皮質(zhì)激素被廣泛用作各種自身免疫和炎癥疾病的抗炎和免疫抑制藥物[1]。過量或長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對(duì)骨骼造成若干不利影響，包括骨質(zhì)疏松癥[2]。研究表明，糖皮質(zhì)激素抑制成骨細(xì)胞的生存和分化能力，這被認(rèn)為是糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)流失過程中的一個(gè)重要機(jī)制[3]。而且，目前沒有針對(duì)由糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥的特效治療藥物[2-4]。

褪黑素是一種從松果體中分離出來的胺類物質(zhì)[5]，已知能調(diào)節(jié)許多生物作用，包括晝夜節(jié)律[6]、調(diào)節(jié)睡眠[7]，以及對(duì)免疫應(yīng)答及抗氧化保護(hù)的作用等[8-10]。許多研究表明，褪黑素參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化[11-14]，特別是低濃度褪黑素被證實(shí)可以在體外和體內(nèi)增強(qiáng)骨形成[15-18]。然而，褪黑素能否緩解糖皮質(zhì)激素所導(dǎo)致的成骨分化障礙尚不明確。因此，本研究旨在探究褪黑素可否緩解地塞米松導(dǎo)致的小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化障礙，并闡明相應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器a-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素溶液、胰蛋白酶(以色列Bioind公司)，DMSO、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、褪黑素、泛素化酶抑制劑MG132(美國(guó)Sigma公司)，BMP/TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制劑LDN193189 (中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，超微量分光光度計(jì)(Nanodrop，美國(guó)Thermo公司)，Roche Light Cycler? 480 II system qPCR儀器(瑞士Roche公司)，PCR逆轉(zhuǎn)錄儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，Western穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀、Western電泳槽、ECL發(fā)光儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分組與成骨分化誘導(dǎo)細(xì)胞系為小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞，從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫購買。細(xì)胞培養(yǎng)于37 °C,5% CO2環(huán)境下的細(xì)胞完全培養(yǎng)基中(a-MEM培養(yǎng)基∶血清∶雙抗=100∶6∶1)。將MC3T3-E1細(xì)胞分別為對(duì)照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)液)、骨誘導(dǎo)組(骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基)、地塞米松組(骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基+100 μmol/L地塞米松)、褪黑素組(骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基+100 μmol/L地塞米松+1 μmol/L褪黑素)、信號(hào)通路組(骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基+100 μmol/L地塞米松+1 μmol/L 褪黑素+1 μmol/L LDN193189)與泛素化酶組(骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基+100 μmol/L 地塞米松+1 μmol/L 褪黑素+5 μmol/L MG132)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，更換為骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基(細(xì)胞完全培養(yǎng)基+50 mg/mL L-抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)進(jìn)行分化誘導(dǎo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)7 d或28 d，每2～3天更換新鮮骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基，可根據(jù)不同需要在骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基加入不同濃度地塞米松、褪黑素、抑制劑等。

1.3qRT-PCR法根據(jù)miRNeasy RNA Mini Kit (Qiagen，USA)說明書提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GoScriptTMReverse Transcription Mix,Oligo (dT) (Promega,USA)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照GoTaq?qPCR Master Mix (Promega,USA)說明書要求，應(yīng)用Roche Light Cycler? 480 II system (Roche,Switzerland)按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行qRT-PCR，設(shè)置95 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參。應(yīng)用程序自帶軟件計(jì)算結(jié)果。使用的引物序列如下，ALP基因正鏈5-3′ATCTTTGGTCTGGCTCCCATG,反鏈5′-3′TTTCCCGTTCACCGTCCAC;OCN基因正鏈5′-3′CTCCCATTGGCGAGTTTG，反鏈5′-3′TGTAGTCCAGGTGGAGCTTGTG；COLL-1基因正鏈5′-3′ACCTCCCAGTGGCGGTTATGAC，反鏈5′-3′AGTTCTTCTGAGGCACAGACGG；Runx2基因正鏈5′-3′TTTGCAGTGGGACCGACA，反鏈5′-3′AGCCATGGTGCCCGTTAG；GAPDH基因正鏈5′-3′AGAAAAACCTGCCAAATATGATGAC，反鏈5′-3′TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC。

1.4Western blot法應(yīng)用含1%蛋白酶抑制劑及1%磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品配平及變性，將蛋白樣品按要求加入SDS-PAGE凝膠中，進(jìn)行電泳，180 mA 70 min轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，去掉封閉液后，加入一抗4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL發(fā)光儀顯影曝光，用Image J軟件計(jì)算條帶灰度值，再用Graphpad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖。使用抗體如下anti-Runx2(#12556 rabbitmAb,Cell Signaling Technology Inc.);anti-Smad1(#6944 rabbit mAb,Cell Signaling Technology Inc.);anti-phospho-SMAD1/5/9(#13820 rabbit mAb,Cell Signaling Technology Inc.);anti-Smurf2(#sc-393848mousemAb,Santa CruzBiotechnology Inc.);anti-GAPDH(#60004-1-lg mouse mAb,Protein Tech Group Inc.);anti-Rabbit IgG(H+L)(#SA00001-2,Protein Tech Group Inc.);anti-Mouse IgG(H+L) (#SA00001-1,Protein Tech Group Inc.)

1.5ALP活性檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞根據(jù)需要分別用骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基、地塞米松、褪黑素和不同種類的抑制劑處理7 d，應(yīng)用無磷酸酶抑制劑的裂解液提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，然后根據(jù)ALP活性檢測(cè)試劑盒(中國(guó)南京建成有限公司)的說明書進(jìn)行檢測(cè)。最后使用酶標(biāo)儀在520 nm處測(cè)量堿性磷酸酶活性的吸光度。

1.6ALP染色MC3T3-E1細(xì)胞根據(jù)需要分別用骨分化細(xì)胞培養(yǎng)基、地塞米松、褪黑素和不同種類的抑制劑處理7 d，然后在室溫下固定在4%的多聚甲醛中15 min，用PBS沖洗3次，并按照BCIP/NBT ALP染色試劑盒的制造商的說明書進(jìn)行染色，用相機(jī)進(jìn)行拍照保存。

1.7茜素紅S染色及定量MC3T3-E1細(xì)胞根據(jù)需要處理28 d后，4%的多聚甲醛中固定15 min，用雙蒸水沖洗后加入茜素紅S染色液30 min。再次用雙蒸水沖洗，用相機(jī)和顯微鏡進(jìn)行拍照保存。加入10%氯化十六烷基吡啶一水(中國(guó)大連美侖有限公司)室溫溶解1 h，使用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)量吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 地塞米松對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OCN、COLL-1 mRNA 表達(dá)的影響與骨誘導(dǎo)組比較，地塞米松組100 μmol/L濃度時(shí)成骨分化相關(guān)基因(ALP、OCN、COLL-1)mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 地塞米松對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞中ALP、OCN、COLL-1 mRNA 的表達(dá)影響Table 1 Dex decreased mRNA expression of ALP,OCN and COLL-1 in MC3T3-E1 cells

2.2褪黑素及地塞米松對(duì)ALP、OCN、COLL-1、Runx2 mRNA表達(dá)的影響褪黑素組、骨誘導(dǎo)組MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OCN、COLL-1、Runx2 mRNA的表達(dá)水平較地塞米松組明顯升高(P<0.05)。骨誘導(dǎo)組MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OCN、COLL-1、Runx2 mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。表明1 μmol/L褪黑素可以緩解地塞米松對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、OCN、COLL-1、Runx2 mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)。見表2。

表2 褪黑素及地塞米松對(duì)ALP、OCN、COLL-1、Runx2 mRNA表達(dá)的影響Table 2 Melatonin attenuated dex-induced decrease of ALP,OCN,COLL-1 and Runx2 mRNA expression in MC3T3-E1 cells

2.3褪黑素及地塞米松對(duì)ALP活性的影響與對(duì)照組、地塞米松組比較，骨誘導(dǎo)組可以顯著提升ALP酶活性；褪黑素組較地塞米松組顯著增加了ALP酶活性。見圖1。表明褪黑素可緩解地塞米松對(duì)ALP活性的抑制。

圖1 褪黑素可緩解地塞米松對(duì)ALP活性的抑制Figure 1 Melatonin attenuated dex-induced decrease of the ALP activity

2.4褪黑素及地塞米松對(duì)細(xì)胞礦化能力影響與對(duì)照組、地塞米松組比較,骨誘導(dǎo)組可以顯著提高茜素紅染色定量表達(dá)(P<0.01)；褪黑素組較地塞米松組顯著增加了茜素紅染色定量表達(dá)(P<0.01)。見圖2。表明褪黑素可緩解地塞米松對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化能力的抑制。

a：對(duì)照組；b：骨誘導(dǎo)組；c：地塞米松組；d：褪黑素組圖2 褪黑素可緩解地塞米松對(duì)細(xì)胞礦化能力的抑制Figure 2 Melatonin attenuated Dex-induced decrease of mineralization in MC3T3-E1 cells

2.5褪黑素及地塞米松對(duì)Runx2表達(dá)的影響與對(duì)照組、地塞米松組比較，骨誘導(dǎo)組可以顯著提升Runx2蛋白含量(P<0.05)；與地塞米松組比較，褪黑素組顯著增加了Runx2蛋白含量(P<0.05)。見圖3。表明褪黑素可以緩解地塞米松對(duì)Runx2蛋白含量表達(dá)的抑制效果。

1：對(duì)照組；2：骨誘導(dǎo)組；3：地塞米松組；4：褪黑素組圖3 褪黑素可緩解地塞米松對(duì)Runx2表達(dá)的抑制Figure 3 Melatonin attenuated Dex-induced decrease of Runx2 expression by western blot

2.6LDN193189及褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用與褪黑素組比較，信號(hào)通路組顯著降低了Runx2蛋白含量(P<0.05)，見圖4，表明LDN193189能明顯廢除褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用。

2.7褪黑素對(duì)P-Smad1/5/9表達(dá)的影響與地塞米松組比較，褪黑素組顯著增加了P-Smad1/5/9蛋白含量(P<0.05)，見圖5，表明褪黑素可以增加P-Smad1/5/9的表達(dá)。

2.8Smurf2及褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用泛素化酶組Runx2蛋白含量表達(dá)較褪黑素組顯著降低(P<0.05)，Smurf2表達(dá)顯著增高(P<0.05)。見圖6。表明MG132能明顯廢除褪黑素對(duì) Runx2 的緩解作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Runx2的降低伴隨著Smurf2的升高。

1：對(duì)照組；2：骨誘導(dǎo)組；3：地塞米松組；4：褪黑素組；5：信號(hào)通路組圖4 LDN193189能明顯廢除褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用Figure 4 LDN193189 significantly reduced melatonin-induced Runx2 expression by western blot

1：地塞米松組；2：褪黑素組圖5 褪黑素可以增加P-Smad1/5/9的表達(dá)Figure 5 Exposure of 1 μM melatonin caused a signicant increase of P-Smad1/5/9 expression by western blot

1：褪黑素組；2：泛素化酶組圖6 Smurf 2介導(dǎo)的泛素化途徑參與褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用Figure 6 melatonin rescues Dex-induced inhibition of Runx2 expression along with the involvement of the ubiquitination mediated by Smurf2 by western blot

3 討 論

糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松是常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。地塞米松(Dex)是人工合成的糖皮質(zhì)激素之一，在臨床治療中使用廣泛，但是長(zhǎng)時(shí)間、大劑量應(yīng)用對(duì)骨形成具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高濃度的地塞米松(>107M)顯著抑制了成骨細(xì)胞的成骨分化和礦化能力[3-4,19]。抑制成骨細(xì)胞增殖和分化被認(rèn)為是糖皮質(zhì)激素引起骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因素[2,4]。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)100 μmol/L地塞米松是對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化抑制性最強(qiáng)的濃度。然而，針對(duì)治療糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松目前并沒有特效的促骨生成藥物，因此，迫切需要開發(fā)一種能有效治療由糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松的藥物。

有證據(jù)表明，褪黑素能增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)以及前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化和礦化的能力[17,20-22]，這種效果通常伴隨著Runx2 表達(dá)的增加[16,23-25]。Runx2是runt域家族的成員，在成骨細(xì)胞的分化和成熟中作為重要的轉(zhuǎn)錄因子起著至關(guān)重要的作用[26-27]，并抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞的分化[28]，敲除Runx2基因小鼠顯示出完全性骨生成障礙[29]。Runx2與成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、I型膠原蛋白(COLL-1)、骨脂蛋白(BSP)及骨橋蛋白(OPN)等主要成骨相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)[30-32]。

成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的平衡維持著骨的穩(wěn)態(tài)[32]。眾多信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞分化的過程[33]，其中BMP/Smads信號(hào)通路是激活成骨細(xì)胞分化及骨形成十分重要的一條通路[34-35]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為BMPs對(duì)成骨細(xì)胞分化及骨形成具有特異性誘導(dǎo)作用[36]。BMP/Smad信號(hào)通路的激活通過磷酸化的Smad1/5/9誘導(dǎo)Runx2表達(dá)，然后Runx2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化與成熟[25,34]。在此過程中，泛素蛋白酶體系統(tǒng)在BMP/Smads信號(hào)通路中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，尤其是屬于E3泛素連接酶的Smurf蛋白，Smurf1/2是 BMP/Smads信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能特異性識(shí)別和結(jié)合Runx2及Smad1，促使它們經(jīng)過泛素蛋白酶體途徑降解，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)BMP/Smads信號(hào)通路，抑制成骨細(xì)胞分化及骨形成[16,37-38]。所以，我們?cè)诒敬卧囼?yàn)中著重檢測(cè)了Runx2的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)經(jīng)過地塞米松處理的MC3T3-E1細(xì)胞分化和礦化能力具有緩解作用，而且褪黑素介導(dǎo)的對(duì)成骨細(xì)胞分化和礦化能力的緩解作用依賴于Runx2的表達(dá)增高。我們進(jìn)一步使用BMP/Smad信號(hào)通路抑制劑發(fā)現(xiàn)BMP/Smad信號(hào)通路在褪黑素對(duì)地塞米松的緩解作用中占主導(dǎo)位置，并通過檢測(cè)BMP/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白P-Smad1/5/9的表達(dá)，證實(shí)了褪黑素激活了BMP/Smad信號(hào)通路，最后我們加入泛素化酶抑制劑MG132，我們發(fā)現(xiàn)MG132明顯廢除褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用，并伴隨著Smurf2升高，證實(shí)Smurf2介導(dǎo)的泛素化途徑參與褪黑素對(duì)Runx2的緩解作用。

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)了褪黑素可以緩解地塞米松對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化和礦化的抑制作用，同時(shí)BMP/Smad信號(hào)通路為主導(dǎo)通路，而且這種調(diào)控作用依賴于Smurf2介導(dǎo)的泛素化途徑。